| Research Abstract |
パーキンソン病動物モデルにおける神経幹細胞移植では, 移植細胞の生着率が低いなど, 臨床応用に向けて多くの課題が残されている. 我々はケトン体が神経保護作用を有することを報告している. 本研究では, ドパミン神経幹細胞の移植へのケトン体の応用を検討した.
I. 神経幹細胞の培養と分化・増殖
胎生ラット中脳を採取し, 中脳組織は離散後, プラスチックフラスコで培養し, bFGFを投与して神経幹細胞を育成した. 中脳由来神経幹細胞は培養3日目より増殖を始め, 9日で増殖細胞塊を形成した.コーティングを施していないプラスチックフラスコにFGF-2添加無血清増殖培地で培養を続けると, 神経sphereが形成され, 継代増殖可能であった. このsphereは無血清保存液を用いて増殖能・分化能を損なわずに凍結保存が可能であり, 効率的に神経幹細胞が得られた.
神経幹細胞の分化・増殖において, ケトン体(D-βhydroxybutyrate ; bHB)の中脳由来神経幹細胞の増殖と分化に対する効果および神経栄養因子や刺激シグナル(BDNF, GDNF, dopamineやpramipexolなどのdopamine agonist, Retinoic acid, folskoiin等)とケトン体の効果をRT-PCR法および蛍光免疫染色法により分析した. また, pramipexoleの神経保護効果の検討も行った. 種々の誘導によりneurosphereから神経系細胞へ分化したが, ドパミン系神経細胞への分化は乏しかった.
II. パーキンソン病モデルラットへの神経幹細胞移植
成体雄SDラット(200〜250g)にネンブタール40mg/kgの腹腔内注射を用いて麻酔を行なった.固定台を用いてラットを固定し, ドリルで頭蓋骨に直径約0.5mmの穴を開け, Manipulatorを用いて線条体に定位的に(target coordinates : anteroposterior(AP), -4.0 ; mediolateral(ML), 0.8;dorsoventral(DV), 8.0mm from bregma), 6-hydroxydopamine(8μg/3μlin saline containing0.2mg/ml ascorbic acid)をハミルトンシリンジで注入してパーキンソン病モデルラットを作成し, 6-hydoroxydopamine注入と同側線条体(target coordhates : AP, 0.5 ; ML, 3.0 ; DV, 5.0mm from bregma)に神経幹細胞単独あるいはケトン体(bHB)を加えた神経幹細胞を移植する神経幹細胞移植におけるケトン体(bHB)の効果の検討を試みた. 安定した実験系の確立が困難であった。
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