2007 Fiscal Year Annual Research Report
くも膜下出血後の脳血管攣縮病態解明に未知なるカルシウムチャンネルより迫る
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19791014
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
藍原 康雄 Tokyo Women's Medical University, 医学部, 助教 (50287372)
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| Keywords | House keeping gene / Ribosomal 18s / TRPチャンネル / degenerate primer / Rea1-time quantitative PCR / Western blotting法 / patch clump手技 / In vitro transcription |
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| Research Abstract |
1;House keeping gene mRNA/protein/Cell Nucleiの定量:
H16年からの研究により、くも膜下出血モデルにおいてはHouse keeping geneの中ではbeta-actin,GAPDHに比較してRibosomal 18sが最も影響を受けないとの結果を元に、血管攣縮に関与すると予想されるTRPチャンネルの発現動態を定量化する時点でのインターナルコントロールの最適なHouse keeping geneとして選出した。TRPチャンネルのファミリーの物質のうち、イヌ遺伝子の塩基配列が既知の物質はその配列を解析に用いた。イヌ遺伝子の塩基配列が未知の物質においては、ヒト遺伝子とその他生物の遺伝子の塩基配列を比較し、両者において相同性の高い部分の塩基配列のdegenerate primerを作成し、プライマーを作成した。摘出した脳主幹動脈よりtotal RNAを抽出し、逆転写酵素とオリゴ(dT)プライマーを用いてcDNAを合成することが出来た。これを鋳型とし、Real-time quantitative PCRを施行し、正常血管と攣縮血管でのTRPチャンネルの発現量の違いを定量するまでに至ったが、データは解析中である。
2;TRP channelファミリーの定量:
TRPチャンネルファミリー(TRP1,2,3,4,5,6,7)は各々特異な組織分布を示し、特に脳内分布でも特徴が見られている。TRPファミリーは機能的にも多様性を有している。平滑筋においてはTRP6がアゴニスト刺激による収縮のトリガーとして働くことが示唆されているが、脳血管平滑筋細胞膜においての、それぞれのTRPチャンネルの発現量をこれまでRT-PCRにて定量することに成功した。次にWestern blotting法により蛋白レベルでの変化の裏づけを施行し、In vitro transcriptionまでを目標としている。
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