Research Abstract |
ラット心筋細胞及び多核白血球にsiRNAを導入する実験(In Vitro系) (ラット心筋細胞及び多核白血球の単離)心筋細胞の単離は,過去の文献(Sadoshima J, et. al.JBC,1992)の通り,ラット多核白血球の単離は比重遠心(Histopaque-1119,-1083)にて行った。 (siRNAの作成)NF-κBp50,p65,IκBα Kinase,p38 MAP Kinase,Akt KinaseをターゲットにしたsiRNA塩基配列作成した。 (Nucleofection法によるsiRNA導入,及び遺伝子発現抑制効果の確認)ラット心筋細胞又は,多核白血球を,Nucleofector Solution内に2-5x106cells/100μ1に播種しsiRNA1.5μgを添付後,Amaxa siRNA Nucleofection Programに従いsiRNAの導入を行った。24-72時間CO2インキュベーターにて培養後に細胞回収しノックダウンの効果を確認した。 ラット心筋細胞単培養,及び多核白血球共培養による虚血再還流後心筋細胞障害の評価(In Vitro系)Anaeropack(三菱ガス化学)を用いて,1%02,5%CO2/95%N2環境下に24時間,細胞を培養後,95%Air/5%CO2インキュベーターで6時間培養することで心筋虚血再還流モデルをIn Vitroで行い,NF-κBp50,p38 MAP Kinaseノックダウン群において,IL6,IL8,TNF alpha放出の抑制をみた。
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