2008 Fiscal Year Annual Research Report

ピンポイントプロテオーム解析による植物病原体応答新規因子の探索と機能解明

Research Project

Project/Area Number	19880019
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	森山陽介 Nara Institute of Science and Technology, バイオサイエンス研究科, 研究員 (00452532)
Keywords	シロイヌナズナ / プロテオーム / うどん粉病
Research Abstract	代表的な病原糸状菌であるうどん粉病菌に対する応答機構を解明し抵抗性を獲得した植物を作成することは、近い未来に訪れる食糧危機の克服に大きく寄与すると考えられる。本研究では局所的・局時的なサンプルを用いたピンポイントのプロテオーム解析による、植物のうどん粉病菌感染初期における病原体応答に関わる因子の探索と機能解析を目的とした。うどん粉病菌は葉の表皮細胞のみに感染する。まずプロテオーム解析のためにパラフィン切片からマイクロダイセクションでシロイヌナズナ葉の表皮細胞のみの回収を試みたが、充分量のサンプルを集めることが非常に困難であった。そこで感染葉全体を用いて二次元電気泳動を行った。その際に通常は解析困難な膜画分のタンパク質を解析できる新規の等電点電気泳動法を取り入れた解析を行った。対照サンプルは感染/非感染の野生株と罹病性変異体を用い、抵抗性反応を差し引いた病原体の認識に関与する因子も同定した。うどん粉病菌感染時に特異的に変動する22種のタンパク質が同定され、これらについてT-DNA挿入変異体を入手しうどん粉病菌に対する罹病性の変化を解析中である。また、promoter::GUSとGFP、35s::CDsとGFP-CDsのコンストラクトを作成し、野生型と変異体に導入してうどん粉病菌感染時の発現部位と機能を確認する準備を進め、現在T2世代の確認中である。あわせて、感染葉全体を用いた定量的RT-PCRによりこれら22の遺伝子の転写量を感染から経時的に調べ、葉全体の転写量の変動とタンパク質の蓄積量が一致しないものを明らかにした。これらは感染表皮特異的なタンパク質蓄積と考えられる。また、上記のサンプルを用いて高精度、高感度なフーリエ変換型質量分析機であるOrbitrapを用い、ショットガンプロテオームにより、さらに微量なタンパク質の変動を網羅的に解析中である。