2020 Fiscal Year Annual Research Report
Quantitative analysis of rRNA foding triggered by specific molecular crowding in nucleolus
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19F19337
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
杉本 直己 甲南大学, 先端生命工学研究所, 教授 (60206430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
GHOSH SAPTARSHI 甲南大学, 先端生命工学研究所, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2019-11-08 – 2022-03-31
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| Keywords | DNA二重鎖 / 構造安定性 / 熱力学 / 分子クラウディング / 安定性予測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞核内に存在する核小体で起こるリボソームRNA(rRNA)の形成における分子環境の効果を定量的に解析することを目的とする。そのために、2020年度は核小体内クラウディング環境におけるDNA二重鎖の構造安定性を予測する手法の開発を検討した。2019年度の成果では40%PEG200および0.1 M NaClが含まれる溶液中において、任意のDNA配列の二重鎖構造の安定性を予測できるパラメータを決定することができたが、限られたクラウディング環境下でのみ成り立つものであった。そこで2020年度ではDNA二重鎖の構造安定性と分子クラウディングの物理化学的特性（主に水の活量変化）の間の相関性を精密に解析することで、様々な塩濃度や分子クラウディング環境で活用できる予測パラメータの開発に成功した。(PNAS, 117, 14194 (2020))。さらに、転写反応中に生じるRNA/DNAハイブリッド二重鎖に関しても、同様の手法を用いて予測法の開発を行った（Nucleic Acids Res., 48, 12042 (2020))。また、rRNAの構造形成予測に必要なRNA-RNA二重鎖に関しても現在解析を進めており、論文投稿準備中である。
rRNAの転写反応に関する実験も進め、rDNAの部分配列をコードする鋳型DNAの合成を行った。さらに、T7 RNAポリメラーゼを用いた予備的な転写反応の解析を行い、分子クラウディング環境が転写反応の触媒自体に及ぼす影響を検討した。一方、HeLa細胞からRNAポリメラーゼIの精製を試みたが困難を極めたため、今後の実験はT7 RNAポリメラーゼをモデルとした研究を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子クラウディング環境の影響を考慮した核酸二重鎖構造の安定性予測はこれまで報告が無かったが、本研究によってDNA-DNA、RNA/DNAハイブリッド、およびRNA-RNA二重鎖の安定性予測を決定することができた。成果も論文発表および投稿準備中である。これらの予測法はrRNAへの転写反応の鋳型配列依存的な転写速度を予測するのに不可欠であり、今後のrRNAの転写及びフォールディングの研究の進展が期待できる。新型コロナウイルス感染症の影響により転写反応の解析等一部に研究の遅れがあるが、概ね現在まで研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は2020年度に引き続き、RNA-RNA二重鎖の安定性の解析を進め、予測法を完成させる。また、分子クラウディング環境下での転写反応に対する影響を検討する。ヒト由来のrDNA配列から調製したDNAテンプレートとRNAポリメラーゼを分子クラウディング環境を変えながら行う。得られる転写産物の量から転写速度を、転写産物の構造からフォールディング効率を定量的に調べる。さらに、各種核酸構造安定性の予測値と転写速度および転写産物の二次構造を関連付ける。以上から、核小体内環境がリボソームRNAのフォールディングに及ぼす影響を定量的に解明する。
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