2020 Fiscal Year Annual Research Report
Investigating the structural conversion mechanism of DNA strands by new single molecule spectroscopy
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19F19340
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
田原 太平 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (60217164)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
HEO WOOSEOK 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2019-11-08 – 2022-03-31
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| Keywords | 一分子ＦＲＥＴ / ＤＮＡダイナミクス / 二次元蛍光寿命相関分光法 / マイクロ流路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、以下に述べる研究を行った。
１．走査型二次元蛍光寿命相関分光法（2D-FLCS）を用いたDNAホリデイジャンクション（HJ）の構造異性化ダイナミクスの計測
HJにはエネルギー的に等価な二つの構造異性体が存在する。室温溶液中でこれらは平衡状態にあり、互いに自発的に異性化すること、またマグネシウムイオン（Mg2+）濃度に依存して異性化速度が劇的に変化することが知られている。本年度は、開発した走査型2D-FLCSを応用し、HJの構造異性化をMg2+濃度を変えながら測定した。その結果、まず蛍光相互相関信号の解析から、異性化の時定数が約25マイクロ秒（[Mg2+] = 0.02 mM）から30ミリ秒（[Mg2+] = 10 mM）まで大きく変化することが分かった。これまでの研究では、最短で100マイクロ秒程度までの時定数しか求められていなかったことから、蛍光相関解析の高い時間分解能が確かめられた。次に、2D-FLCS解析から、二つの構造異性体に帰属される独立蛍光成分が得られた。各成分の蛍光寿命分布は複数のピークをもち、また平均蛍光寿命とFRET効率はMg2+濃度に依存する変化を示した。これから、各構造異性体は複数の準安定状態からなっており、マイクロ秒以下の時間スケールで相互変換していること、またMg2+濃度に依存してその分布が変化することが分かった。
２．2D-FLCSとラピッドミキシング法を用いた非平衡状態の構造不均一性の研究
本課題では、マイクロ流路デバイスを用いて生体試料と構造変化を誘起する試薬を急速混合し、混合試料が流れる流路上で観測位置を変えながら2D-FLCSを行うことで、非平衡中間状態の構造不均一性を検出することを試みる。今年度は、PDMSポリマー製のマイクロ流路チップを用い、高精度空圧送液ポンプで溶液をフローさせながら2D-FLCS計測を行うシステムを製作した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
走査型2D-FLCSの開発においては、予定通りマグネシウムイオン濃度依存性のデータを取得し、その結果、独立蛍光成分が示す系統的な変化を見いだすことができた。この結果をもって論文化にメドが立ったと考えており、本課題はきわめて順調に進行していると判断できる。
ラピッドミキシング法を用いた非平衡状態の計測については、当初の計画通りマイクロ流路デバイスを用いた測定システムの製作が進んでいる。マイクロ流路のデザインに関して最適化を要する点が残っているが、次年度に2D-FLCS計測を行う環境が整いつつあり、本課題についても順調に進行していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までの進捗状況を踏まえ、今後以下のように研究を進める。
１．走査型2D-FLCSの応用では、本年度までに行ったHJの実験の結果を解釈するため、HJの構造およびダイナミクスの不均一性及びマグネシウムイオンの効果に関する先行研究の調査を行う。それに基づき実験結果を説明する分子モデルを構築し、HJの異性化ダイナミクスの全容を明らかにする。得られた成果を学会で発表するとともに、論文化する。
２．非平衡状態の計測については、2D-FLCSとラピッドミキシング法を組み合わせた手法の開発を継続する。本年度までに、PDMSポリマー製マイクロ流路チップを試験的に導入し、新たに購入した高精度空圧送液ポンプを用いてその性能を評価した。その結果、流路形状に起因する時間原点の不定性の問題とリークの問題が重要であることが認識された。これを踏まえ、流路形状を最適化した3流路合流型のチップを新規にデザインし、専門業者に製作を委託する。次にこのチップを用いた溶液の高速混合による非平衡状態の2D-FLCS測定に進む。試料としてはDNAのi-モチーフを用いる。pHジャンプによりi-モチーフ構造の形成を誘起し、それにより生じた非平衡中間状態の構造分布と時間変化を、10ミリ秒程度の時間分解能で追跡する。３つの流路のうち中央の流路に試料溶液を低圧で導入し、両側の流路に酸性バッファーを高圧で導入することで、流体力学的絞り込み効果により試料溶液の流束幅を圧縮し、プロトンの拡散によるpHジャンプの時間分解能を高めることができる。試料DNAはFRET対となる蛍光色素のペアを二重標識したものを用いる。この試料の非平衡中間状態の2D-FLCS測定により、複数の構造形成経路の存在可能性を検討するとともに、平衡条件下の中間状態との違いを明らかにする。これらを基に、i-モチーフの構造形成機構のモデルを構築する。
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Research Products
(4 results)
