2019 Fiscal Year Annual Research Report
Rapid pattern recognition of OncomiR by DNA computation
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19H00901
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
川野 竜司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (90401702)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 宏明 中央大学, 理工学部, 教授 (20372427)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | リキッドバイオプシー / ナノポア / microRNA / DNAコンピューティング / マイクロデバイス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではDNAコンピューティング技術とナノポア計測によるラベルフリーDNA分子検出法を組み合わせることにより、早期がん診断マーカーとして期待されるmicroRNA（miRNA）群のがんパターン診断法の構築をめざす。がんに罹患すると体液中に存在する遊離DNA/RNAのプロファイルが変化することから、体液を用いた早期がん診断が低侵襲がん診断として期待されている。現在核酸プロファイルを調べるためにはマイクロアレイ法や定量PCR法が必要なため、迅速・低コスト診断には課題が残る。申請者はこれまで、ナノポア計測によるDNA演算出力分子の迅速検出、これを利用したmiRNA群のパターン診断への応用について研究してきた。最近我々が開発した胆管癌時に発現亢進する5種miRNAパターン認識法が、実際のがん患者の血液検体にも適用可能であることを見出した。本提案では、これまで情報科学的視点から研究されてきたDNAコンピューティング技術をナノポア計測と組み合わせ、かつmiRNA群のパターン認識に関する基礎的な知見に基づいて、迅速・簡便な体液からのがん早期診断法の確立を目指す。
今年度は熱力学的シミュレーションを用いた診断用DNA設計法の最適化、実検体を用いた計測、また胆管癌以外の口腔扁平上皮癌を診断するためのmiRNAパターンの決定をマイクロアレイ解析および先行研究のメタアナリシス解析に関して行った。これらの実験を推進する中で、これまでナノポア計測では計測不可能であった超低濃度領域（~fM）のmiRNAを検出する方法を発見した。分担者の鈴木は、別のアプローチからの診断の高感度化を見据え、リポソーム内核酸増幅法の確立に取り組んでいる。その基盤技術としての、均一リポソーム製造法の開発に取り組んだ。今年度はこれらに関連する成果に関して、査読付き論文2報、特許1件出願、国内外の複数の学会において公表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
複数の研究課題を推進したが、最も大きな成果であると考えている、超低濃度検出技術の発見について述べる。従来ナノポア計測における核酸分子の検出限界は測定溶液を最適化することでおよそ~1 pM程度であった。体液中のmiRNAを定量する場合この1 pM以下のサブpMレベルの検出が要求される。申請者はこれまで核酸分子を等温で増幅可能な等温増幅法とDNAコンピューティング技術を組み合わせることにより1 fMのmiRNAの検出に成功している（Nanoscale 2017）。しかしながらこの方法では複数の増幅用核酸や酵素が必要になり、実検体からの検出を行うためには複雑な条件検討が必要になってくる。今年度申請者が設計した診断用ＤＮＡを用いると実検体中のmiRNAが検出できているようなデータを得ることが出来た。実検体中のmiRNAの濃度を定量ＰＣＲで定量したところ、やはりサブpM～fMの濃度であることがわかり、なぜナノポアで検出できたのか不明であった。これを解明するためいくつかの検討を行ったところ診断用ＤＮＡが重要であることが明らかになってきた。現在特許出願手続き中のため詳述は避けるが、miRNAの相補鎖になる診断用ＤＮＡの設計が鍵となる可能性が極めて高いことを見出した。
分担者の鈴木は、PDMS製流路およびガラスキャピラリを組み合わせた流路デバイスという二つの技術を用い、WOWエマルションをテンプレートとした均一リポソーム製造技術の開発を行った。どちらの技術においても、均一リポソームの生成が可能な条件範囲を見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度推進中の課題を引き続き推進する。具体的には胆管癌由来miRNAの実検体からの診断法の最適化、診断用ＤＮＡの設計の最適化、胆管癌以外の口腔扁平上皮癌（OSCC）をナノポア診断するためのmiRNAパターンの決定と超低濃度検出のメカニズム解明を行う。またこれまで申請者らが開発してきたDNAコンピューティング技術基盤のナノポア計測では、miRNAの発現が向上する場合のパターン認識には成功しているが、発現減少、発現上昇・減少が同時に起こる場合に関してもそのパターンを認識する方法が求められる。今年度は、DNAコンピューティング技術を用いてこの発現上昇・現象が同時に起こる系を診断可能なシステムの構築に取り組む。
均一リポソームの製造法に関しては、リポソームを生成可能な条件範囲が予想以上に狭く、またその物理的性質も従来法で作成したリポソームと大きく異なることも明らかになった。そのため、汎用技術への展開を目指し、技術さらなるキャラクタリゼーションおよび簡素化を進める。
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