2020 Fiscal Year Annual Research Report
Rapid pattern recognition of OncomiR by DNA computation
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19H00901
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
川野 竜司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90401702)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 宏明 中央大学, 理工学部, 教授 (20372427)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNAコンピューティング / ナノポア計測 / マイクロ流体技術 / リポソーム / コアセルベート |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではDNAコンピューティング技術とナノポア計測によるラベルフリーDNA分子検出法を組み合わせることにより、早期がん診断マーカーとして期待されるmicroRNA（miRNA）群のがんパターン診断法の構築をめざす。がんに罹患すると体液中に存在する遊離DNA/RNAのプロファイルが変化することから、体液を用いた早期がん診断が低侵襲がん診断として期待されている。現在核酸プロファイルを調べるためにはマイクロアレイ法や定量PCR法が必要なため、迅速・低コスト診断には課題が残る。申請者はこれまで、ナノポア計測によるDNA演算出力分子の迅速検出、これを利用したmiRNA群のパターン診断への応用について研究してきた。最近我々が開発した胆管癌時に発現亢進する5種miRNAパターン認識法が、実際のがん患者の血液検体にも適用可能であることを見出した。本提案では、これまで情報科学的視点から研究されてきたDNAコンピューティング技術をナノポア計測と組み合わせ、かつmiRNA群のパターン認識に関する基礎的な知見に基づいて、迅速・簡便な体液からのがん早期診断法の確立を目指す。
今年度は、昨年度見出してきた超低濃度領域のmiRNAナノポア計測の現象解明とmiRNAの発現上昇・減少を同時に識別可能なDNAコンピューティングの開発をおこなった。これまでナノポア計測では計測不可能であった超低濃度領域（~fM）のmiRNAを検出する方法を発見したが、その機構は不明であり、モデル実験系を組みメカニズムの解明を試みた。
分担者の鈴木は、別のアプローチから検出の高感度化を見据え、リポソーム内核酸増幅法の確立に取り組んでいた。今年度はより効率的な濃縮法の確立を目指しリポソーム以外にコアセルベートを用いる手法を検討した。今年度はこれらに関連する成果に関して、査読付き論文6報、国内外の複数の学会において公表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度見出したmiRNAの超低濃度検出のメカニズム解明を試みた。従来ナノポア計測における核酸分子の検出限界は測定溶液を最適化することでおよそ~1 pM程度であった。体液中のmiRNAを定量する場合、この1 pM以下のサブpMレベルの検出が要求される。本研究で申請者が設計した診断用ＤＮＡを用いると実検体中のサブpM～fMのmiRNAが検出できていることがわかった。これに関し、より単純な系で現象を理解するために、モデルDNAとプローブを作製し、メカニズム解明に取り組んだ。その結果、miRNAの相補鎖になる診断用ＤＮＡの設計と標的分子とプローブとの濃度差により低濃度検出が可能になっていることが明らかになりつつある。
またmiRNAが発現上昇・減少を同時に識別可能なDNAコンピューティングシステムの構築を行なった。口腔扁平上皮癌のマーカーとなる2種のmiRNAが発現上昇・減少することがマイクロアレイ解析から判明し、これに対しナノポア計測用プローブを作製し、同時認識法の確立に取り組んでいる。
分担者の鈴木は、リポソームを利用した濃縮法に加え（ACS Synthbiol. 2020）、複数種のポリカチオンがmiRNAとコアセルベートを作ることを確認し、miRNA溶液からコアセルベート中にmiRNAが濃縮可能であることがわかった。これを次にナノポア計測系へ適用する方法の確立を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度推進中の課題を引き続き推進する。具体的には超低濃度miRNA検出のメカニズム解明を、実験・理論両方面から明らかにする。また発現上昇・減少するmiRNAをマーカーとする口腔扁平上皮癌（OSCC）をナノポア診断するためのmiRNAパターン識別行う。
紙面の関係で詳述はできていないが、上述以外にもナノポアによるDNAの一塩基変異検出（Small Methods 2020）、NP困難問題に代表される並列計算をナノポアでコーディングに成功するなど、本研究を推進するなかで周辺技術の開発も進んできている。今後はこれらのナノポアデコーティングの技術を組み合わせ、より高度な自律診断システムの構築を目指したい。
分担者の鈴木らが取り組んでいる。物理的なmiRNA濃縮法に関しては、miRNA溶液からmiRNAをある程度選択的に濃縮することに成功した。今後より高効率な濃縮法の条件探索に加え、抽出してきたmiRNAを効率よくナノポア計測系に移行する手法の構築に取り組む。
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