2019 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular analysis of mirror-arabinan present in cell wall polysaccharides of Mycobacteria and its degrading enzymes
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19H00929
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 清貴 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189)
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
隅田 泰生 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (70179282)
新地 浩之 鹿児島大学, 理工学域工学系, 助教 (70770155)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 糖質関連酵素 / 結核菌 / アラビノース / 阻害剤 / 可視化ツール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鏡像体アラビナン分解酵素のうち、Endo-MAとExo-MAの結晶構造解析を進めた。Endo-MAはすでにアポ体の結晶構造を決定していたが、機能解析を進めるために、複合体結晶構造解析と変異体作成に取り掛かった。Endo-MAで６種類の変異体を作成してその活性を調べたが、当初の予想に反し、相互作用が弱かったために、現時点でまだ複合体結晶構造の取得に至っていない。一方、Exo-MAではアポ体の結晶構造決定に成功した。Exo-MAの単量体構造は２つのβ-サンドイッチドメインからなり、N末端側とC末端側に分かれて、ループ構造が存在していた。また、Exo-MAは３量体が４つ集まった１２量体構造を取っていた。多量体形成にはC末端側のループが寄与しており、これをインタラクションループと命名した。
新規酵素探索においては、リポアラビノマンナンのキャップ部分に作用する新規なExo型酵素MA1061を発見した。発現条件検討の結果、N末端側にSKIK配列を入れることにより、大腸菌での異種発現に成功した。現在、詳細な酵素学的性質の解析を進めている。
LAMの部分構造のうち、２２糖を有機合成したものを基質としてEndo-MAでの分解産物の同定を行った。さらに、3糖から9糖までの分岐構造を含むフラグメント構造を４種類合成し、LAMによる酵素分解パターンの解析を行った。
可視化ツール（金属ナノ粒子および糖鎖チップ）の作成に向けては、Endo-MA変異体が作成できた段階である。また、糖鎖チップ用の糖鎖の調製は、市販のLAMを元にした条件検討を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
結晶構造解析においては、Endo-MAとExo-MAの両方でアポ体の結晶構造決定に成功している。一方で、Endo-MAの複合体構造決定は遅れている。
新規酵素探索では、これまで知られていなかったキャップ構造特異的な新規酵素MA1061を発見することができた。現在機能解析を進めているが、既知の酵素とは異なる鏡像体アラビナン中の糖結合に作用することが分かってきており、今後、構造解析も含めた展開を計画している。
有機合成研究においては、これまで確立した22糖を用いて、Endo-MAを作用させて産物を解析することにより、LAMの化学構造を明らかにする手がかりを得た。さらに、分岐構造を含むオリゴ糖を４種類して、さらに詳細な構造解析を進めることができた。
可視化ツール（金属ナノ粒子および糖鎖チップ）の作成は、Endo-MA変異体の作成が遅れており、タンパク質と糖鎖サンプルを供給するための条件検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Endo-MAの複合体構造解析は引き続き行う。また、Exo-MAではアポ体の構造精密化に加えて、複合体構造解析および変異体解析を進める。
新規酵素探索では、新規酵素MA1061の機能解析を進めるとともに、これまでの成果をまとめて論文発表する予定である。
有機合成研究では、Endo-MAおよびExo-MAに加えて、MA1061の機能解析に向けた基質合成法の検討を行う。
可視化ツール作成においては、調製されたタンパク質と糖鎖サンプルが供給され次第、ツール作成の条件検討を開始する。
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