2020 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular analysis of mirror-arabinan present in cell wall polysaccharides of Mycobacteria and its degrading enzymes
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19H00929
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 清貴 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189)
隅田 泰生 鹿児島大学, 理工学域工学系, 教授 (70179282)
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
新地 浩之 鹿児島大学, 理工学域工学系, 助教 (70770155)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 糖質関連酵素 / 結核菌 / アラビノース / 阻害剤 / 可視化ツール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鏡像体アラビナン分解酵素のうち、Endo-MAとExo-MAの結晶構造解析を進めた。Endo-MAはこれまでにアポ体の結晶構造を決定していたが、機能解析を進めるために、複合体の結晶構造解析と変異体作成を行った。変異体の活性測定により、Endo-MAの活性中心残基が３つのアミノ酸(D33, D51, E243)に絞られた。一方、Exo-MAはこれまでアポ体の結晶構造を決定していた。Exo-MAの単量体構造は２つのβ-サンドイッチドメインからなり、N末端側とC末端側に分かれてループ構造が存在していた。また、Exo-MAは3量体が４つ集まった１２量体構造を取っていた。多量体形成にはC末端側のループが寄与しており、これをインタラクションループと命名した。複合体構造を取るために多数の条件を検討した。
これまでの新規酵素探索で発見したMA1061は、リポアラビノマンナンのキャップ構造に作用する新規酵素であった。発現条件検討の結果、N末端側にSKIK配列を入れて大腸菌での異種発現に成功した。その後、精製条件を確立し、多数の結晶化スクリーニングを行った。
LAMの部分構造のうち、22糖を有機合成したものを基質としてEndo-MAでの分解産物の同定を行った。さらに、３糖から９糖までの分岐構造を含むフラグメント構造を４種類合成して、LAMによる酵素分解パターンの解析を行った。それにより判明したEndo-MAの基質特異性を元に、複合体解析に適した基質を見出した。
可視化ツール（金属ナノ粒子および糖鎖チップ）の作成に向けて、リポアラビノマンナンの酵素(Endo-MA)処理サンプルが使えるかどうかの検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Endo-MAでは変異体解析により活性中心残基を３つまで絞り込むことができたものの、複合体構造解析が未だに達成できていない。D-アラビノースの単糖や２糖など、様々な化合物を用いて、共結晶化とソーキングを試しているが、リガンドが結合したデータセットを取ることができていない。また、Exo-MAでも同様に複合体結晶を作成してデータ測定を繰り返しているが、こちらも未だに複合体が取れていない。MA1061は、結晶化スクリーニングを開始したところである。有機合成と酵素分解パターン解析は順調に進んだ。可視化ツール作成は、複雑な糖鎖構造を持つリポアラビノマンナンが固定化に適していないため、酵素処理を行って条件検討を行っている段階であり、まだタンパク質（酵素）の可視化をチェックするところまでは来ていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
有機合成と酵素分解パターン解析により、D-アラビノースの直鎖状のオリゴマーがEndo-MAの複合体取得に適しているという推測が得られた。したがって、このリガンドを用いて、複合体結晶の取得を目指す。これまでと同様に、共結晶化とソーキングを試す。Exo-MAは、類似酵素がD-フルクトフラノシダーゼ活性を持つことが判明しているため、D-アラビノース以外の、フルクトース系の糖をリガンドとして使用する。MA1061は引き続き結晶化スクリーニングを行う。可視化ツール作成については、これまでの条件検討で、リポアラビノマンナンをEndo-MAで処理したサンプルが使える目処が立ったので、条件をより精密に検討して、感度の高いツール作成を目指す。
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