2020 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
19H00936
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
宮崎 健太郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (60344123)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | ゲノム編集 / 23S rRNA / ホーミングエンドヌクレアーゼ / イントロン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
令和２年度は、 高機能23S rRNA遺伝子を取得するため、大腸菌のリボソームオペロン完全欠失株を宿主として、種々の系統に合わせた合計16種類のプライマーをデザインし、それを用いてカルチャーコレクションより取得した異種微生物ゲノムより23S rRNAをPCR増幅し、機能スクリーニングを行った。また、同プライマーを用いて環境メタゲノムを鋳型に23S rRNAをPCR増幅し、機能スクリーニングを行った。その結果、15種類の機能性遺伝子を得た。16S rRNA遺伝子の場合と比較し、系統的な相補域という点では、やや異なった。多くの遺伝子がガンマプロテオバクテリア由来で、アルファプロテオバクテリア由来のものがひつとのみ得られた。
変異株については非常に増殖速度の低下するものからあまり変わらないものまで多様であった。増殖の低下した株（Mme）を継代培養により増殖復帰株の取得を試みたところ、劇的に回復する変異株が得られた。予備的な遺伝子解析の結果、23S rRNA遺伝子には変異が見当たらなかったため、ゲノム内の未知領域に変異が発生したものと思われる。現在、全ゲノム解析により変異の同定を試みている。
また、Rhodothermus marinusと生育環境の類似した高温環境から好熱菌を分離するとともに、ゲノム解析や環境ゲノムの調製等を行った。過去に分離した研究室保有のRhodothermus marinus株について23S rRNA並びにイントロンの有無、配列の違いについて検討したが、8株全てでイントロン含め同一の23S rRNA遺伝子が含まれており、単離した環境では実際にホーミングエンドヌクレアーゼ が機能し、Rhodothermus marinus株間で拡散・蔓延していることが判明した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ホーミングエンドヌクレアーゼ の解析の進捗に遅れが見られる。特に、切断活性のハイスループット系を構築するにあたり、切断後の後処理などが必要なため、種々の工夫を行なっているが、検討を重ねている状況である。酵素の安定性についても好熱菌由来でありながら保存中の失活が見られ、機能解析を阻む原因となっている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
23S rRNA遺伝子については取得した機能遺伝子について論文化を進める。また好熱菌を中心としたゲノム解析についても引き続き進め、論文化を行う。また好熱菌由来のホーミングエンドヌクレアーゼ を活用していることから、大腸菌だけでなく、生育温度の類似した好熱菌への組み込みも検討する。
|
