2019 Fiscal Year Annual Research Report
Control of polymer structure by enzyme: structure-function relationship of cellulose synthase
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19H00950
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 准教授 (90509142)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (40311518)
田島 健次 北海道大学, 工学研究院, 准教授 (00271643)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | セルロース合成酵素 / セルロース / 酢酸菌 / 複合体タンパク質精製 / ターミナルコンプレックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酢酸菌をセルロース生合成研究のモデル生物として選択し，そのセルロース合成酵素複合体の全容解明へ向けた研究を行った。酢酸菌ではCesA，CesB，CesC，CesDの4タンパク質が複合体を形成している。これらのタンパク質複合体の精製を進めるべく，大腸菌へこれらの遺伝子を導入した形質転換体およびもとの酢酸菌に遺伝子操作を行いタグ付きセルロース合成酵素を発現する形質転換体を用いて実験を行った。
まずタンパク質精製であるが，機能上最小構成のCesA/CesB複合体については，タグ精製およびサイズ排除クロマトグラフィーによる高度精製も行い，弱いながらもセルロース合成活性を保持したまま精製が可能であることが見えてきた。また，さらにCesCとCesDを加えたCesABCD複合体についても精製実験を進め，条件検討を繰り返し発現・精製条件の絞り込みを行っている。また最も情報の少ないCesCタンパク質については，そのC末の膜貫通部分と想定される部分領域の構造・機能解析とTPR領域の機能解析にも着手した。
また大腸菌にフル複合体を再構成する試みを開始し，大腸菌形質転換体の作出と導入したタンパク質の発現を確認した。
酢酸菌の細胞上には，セルロース合成酵素複合体が直線状に並んだターミナルコンプレックス（TC）が形成される。このTC形成のメカニズムを探るために，ランダム変異導入実験を開始した。今年度の実験結果に基づき，用いる細胞として蛍光タンパク質を融合したセルロース合成酵素を持つ酢酸菌形質転換体を使って次年度に実験を行う計画とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
使用予定である大腸菌および酢酸菌の形質転換体は，一部計画通りに進んでいないものもあるが，およそ計画に沿って作出できている。それを使ったタンパク質精製については，膜タンパク質複合体であることからまだ条件最適化が必要な状況であるが，想定内である。また大腸菌を使ったセルロース合成活性の再構成についても，計画通り進めている状況にある。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画通り酢酸菌を使ってセルロース合成酵素複合体の全容解明を行う。機能解析は精製タンパク質の試験管内再構成および形質転換体を使った合成生物学的アプローチで行う。構造解析については，フル複合体だけでなく，部分構造の解析も進める。また酵素複合体の直線配置（TC）の責任因子同定については，ランダム変異導入と変異導入部位の次世代シークエンサー解析によるアプローチをメインの方法として実験を進める。
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