2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of real time in vivo imaging method that can monitor tissue inflammation and fibrosis.
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19H00966
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
高橋 智 筑波大学, 医学医療系, 教授 (50271896)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (10633141)
濱田 理人 筑波大学, 医学医療系, 助教 (20567630)
三輪 佳宏 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (70263845)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リサーチバイオリソース / in vivoイメージング / 近赤外蛍光 / iRFP / 遺伝子改変マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1-3. 近赤外多重蛍光観察を可能にする手法の開発
「生体の光学的な窓」を用いて、炎症細胞の動態と膠原線維の蓄積を同時に生体外からモニターするためには、近赤外多重蛍光観察手法を確立する必要がある。iRFPにはピーク波長が異なるiRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720の5つの変異体が存在するが、このピーク波長の違いを検出するためには特殊なカメラが必要となり、広く一般に普及する技術になりにくい。そこで、既に臨床で使用されている近赤外蛍光物質であるインドシアニングリーン（Indo-cyanine Green（ICG）ピーク波長 835nm）を用いることにより、iRFPとICGの二重蛍光観察法を確立した。ICGを用いることにより、iRFPとICGの二重蛍光観察を行うコットができた。また、様々な蛍光色素を後付けで染色できるHalo-Tagシステムを導入することにより二重染色できることも明らかにした。
1-4. 臓器線維化をリアルタイムでモニターできる遺伝子改変マウスの開発
当初の予定では、上記で確立した標識遺伝子を導入した遺伝子をV型コラーゲン遺伝子領域に挿入したノックインマウスをCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術で作製する計画だった。しかし、マウスを作製する前段階としてiRFP遺伝子導入したV型コラーゲン遺伝子を細胞に導入したところ、膠原線維の産生効率が低下することが明らかとなった。そこで遺伝子として小さいGFPまたはHalo-Tag遺伝子を導入したところ、膠原線維の産生には問題ないことが明らかとなった。そこでGFPまたはHalo-Tag遺伝子をV型コラーゲン遺伝子にノックインしたマウスを作製した。その結果、マウスの作製に成功し、このマウスはホモマウスでも異常を示さないこと、産生された膠原線維をGFPまたはHalo-Tagリガンドで染色できることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1-3. 近赤外多重蛍光観察を可能にする手法の開発および1-4. 臓器線維化をリアルタイムでモニターできる遺伝子改変マウスの開発を達成することができた。研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
GFPノックインマウスでは、産生された膠原線維の全てが標識されるので、今まで不明だった発生期の膠原線維の産生の解析を行うことが可能になると考えられる。一方Halo-Tagはリガンドの蛍光を変えることにより、時期特異的な検出が可能になるので、時期得意的な解析に利用したい。
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