2020 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular mechanisms of control of recombination by dynamics of RAD51/DMC1-DNA complexes
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19H00981
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
篠原 彰 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00252578)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 相同組換え / 減数分裂 / 染色体 / RAD51 / DMC1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAの交換反応である相同組換えは体細胞分裂期ではDNAの傷、DNA2本鎖切断の修復やDNA複製フォークの停止回復を介してゲノムの安定化に、減数分裂期では相同染色体の分配やゲノムの多様性の産生に必須の役割を果たしている。本研究は、相同組換え反応の中で、最も重要な反応である、RAD51, DMC1によるDNA鎖相同検索、中でも体細胞分裂期では姉妹染色体を、減数分裂期では相同染色体を組換えパートナーとして選抜する仕組みを知るために、RAD51, DMC1に相互作用し、その機能を制御する因子を理解することで、相同検索反応の機能分化の分子メカニズムと制御の解明を目指している。特にヒトRAD51, DMC1メデュエーターとアンチリコンビナーゼに焦点を当て、生化学的、構造生物学的方法によるメカニズム解析と、ヒト細胞とマウス個体レベルの解析を組み合わせることで、細胞内でのRAD51, DMC1フィラメントの動的な連携と染色体による制御を介したゲノムの安定化の仕組みと、その破綻によるゲノム不安定化の分子病態も解明も目的としている。RAD51を制御する新規因子FIGNL1を同定し、組換えにおける役割を解析してきた。特に、FIGNL1のマウス個体や細胞における機能解析を実施した結果、Fignl1 欠損はマウスでは胚性致死を示すことが分かり、精巣特異的なFignl1 コンディショナルノックアウト（CKO）を作成したところ、オスでは不稔になることもわかった。また、減数分裂期組換えにおいてはRAD51に加えて、DMC1フィラメントの動態を制御することが分かった。今後、Fignl1 cKOマウスの詳細な減数分裂欠損の解析を、精巣のみならず、卵巣で実施することで、哺乳類減数分裂期組換えにおけるRAD51・DMC1による相同検索のパートナー選択の分子メカニズムを明らかにできると期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通りにFignl1の精巣特異的cKOマウスを作成でき、解析が進んでいる。現在ではオスのみならず、メスの生殖細胞特異的なcKOマウスの作成と解析に取り組んでいる。また、ヒト培養細胞でもFIGNL1のノックアウト細胞を作成でき、その解析もS期のDNA複製時のDNA 2重鎖切断修復による機能やゲノム安定化に関する解析を進めている。一方、FIGNL1-FLIPの精製は進んでいるが、クライオ電子顕微鏡による構造解析にはより純度の高いタンパク質複合体の精製が必要になる。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規因子として同定したヒトFIGNL1がヒトRAD51-DNA複合体を破壊し、SWSAP1がその破壊活性からRAD51-DNA複合体を保護する機能を有することを見出している。
精製したタンパク質を用いて、この可能性を支持する予備的な生化学的解析の結果も得られている。そのメカニズムの詳細の解析のために、精製したタンパク質FIGNL1やSWSAP1を用いて、試験管内のRAD51集合反応と、より複雑なDNA鎖交換反応の再構成を目指す。RAD51に加えて、減数分裂特異的なDMC1でも同様のアッセイを実施する。ヒトFIGNL1とそのRAD51との複合体のクライオ電子顕微鏡により構造解析を共同研究で実施する。ヒトFIGNL1は単量体では60kDと小さいがAAA+ATPaseファミリーあり、実際は６量体を形成しているため、電顕による構造解析には十分適している。特に組換え反応を電子顕微鏡で１分子観察することを目指す。細胞、個体内での組換え制御因子FIGNL1の機能を明らかにするため、マウスでノックアウトマウスを作成したところ、胚性致死であることが分かった。そのため、Cre-loxPを用いたコンディショナル ノックアウト（CKO)マウスを作成している。作成したマウスは減数分裂期の機能を解析する場合は、Stra8-Creなどの精
巣特異的でノックアウトが出来る様なマウスを作成し、精巣などでの組換えの影響、特にRAD51やDMC1の集合反応への影響を解析する。同時にswsap1のノックアウトと掛け合わせて、swsap1 fignl1の二重変異マウスを作成し、FIGNL1-SWSAP1の拮抗的な関係が個体内でも見られるのかを検証する。FIGNL1とSWSAP1の両者に結合することが知られているSPIDRのノックアウトマウスやヒト細胞を作成し、その表現型を解析する。
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