2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the functional mechanisms associated with structural dynamics of antibodies by integration of cutting-edge measurement approaches
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19H01017
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
加藤 晃一 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 教授 (20211849)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢木 真穂 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 助教 (40608999)
谷中 冴子 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 助教 (80722777)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 抗体 / Fc受容体 / 補体 / 動的立体構造 / 相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫グロブリンG（IgG）のFc領域に結合している糖鎖はFcγ受容体や補体成分との相互作用を介したエフェクター機能に決定的な役割を果たしている。本年度は、Fc領域の構造ダイナミクスに糖鎖が及ぼす影響を精査するために、糖鎖非還元末端の構造（ガラクトシル化やフコシル化の有無）が異なるFcについて、核磁気共鳴（NMR）分光法と分子動力学（MD）計算を用いた動的構造解析に着手した。NMR計測には糖鎖およびポリペプチド鎖に安定同位体標識を施したマウスおよびヒトのFc試料の調製を必要とする。そのため、効率的に試料調製とスペクトル解析を実現するための真核生物発現系を利用した同位体標識技術の改良を行なった。Fc領域全域にプローブを設けることで、NMRを用いた原子レベルでの動的構造解析の基盤を整えた。
一方、抗体分子全体の巨視的構造情報を得るために、溶液散乱法と高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）を利用した計測を引き続き実施した。溶液散乱については、特にFc受容体と相互作用しているIgGの構造情報を得るために、重水素標識によるコントラストマッチングとサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて良質な中性子小角散乱のデータを取得した。
昨年度に実施した研究により、膜上で抗原と特異的に結合したIgGがFc領域間の相互作用を介して自発的に6量体リング構造を形成すること、そしてIgGのFab領域の中にもFcγ受容体と相互作用する部位が存在することが明らかとなっている。本年度は高機能化抗体の創成に向けて、これらの新規相互作用を担う部位に改変を施して、性状評価および機能評価を実施する準備を進めた。
抗体の分子間相互作用をin situにおいてキャラクタライズするために、血清中におかれたヒトIgGのNMR信号の観測を行なった。さらに、得られた成果に基づいて、抗体と血清成分の相互作用の実態解明を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究実施計画はすべて達成し、カイコ蛹を用いた抗体の安定同位体標識技術の開発やマウスIgG-FcのNMR解析が予想を越えて順調に進展し、論文発表に至っている。したがって、研究は当初の計画以上に進展しているものと判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
IgGの３次元構造ダイナミクスを原子レベルで解析するために、これまで技術基盤を整えてきたNMR分光計測実験とMDシミュレーションを本格的に実施する。特に本年度は、抗体医薬のフレームワークとなるヒトIgG1のFc領域を対象に、細胞工学的手法により糖鎖とアミノ酸の生合成経路を改変した動物細胞を用いて、フコシル化やガラクトシル化の様態も含めてN型糖鎖構造をコントロールしつつ、効率的に均一安定同位体標識を施した試料を調製する。多次元NMR計測により、Fcの各グライコフォームについて糖鎖とポリペプチド鎖に由来するシグナルを観測・帰属する。帰属の確定したNMRシグナルをプローブとして、糖鎖構造の改変に伴う分子の動的構造変化を捉える。一方、ヒトIgG1-Fcの各グライコフォームを対象にMDシミュレーションを実施する。分子構造が柔軟な糖鎖をモデル分子として、MDシミュレーションの結果により得られた構造アンサンブルを包括的に取り扱うアプローチ法を確立し、これを糖タンパク質としてのIgG1-Fcに応用することを試みる。NMRデータとMDシミュレーションの結果を統合し、Fcの分子構造の中に張り巡らされた糖鎖-タンパク質の相互作用ネットワークを検出することを目指す。さらに、NMRスペクトル変化を指標に抗体と血清成分との相互作用を評価するとともに、それらがFcγ受容体を介したエフェクター活性に及ぼす影響を定量評価する。全長抗体の動的高次構造解析を行うために、高度に選択性を高めた安定同位体標識を施したIgG試料を調製し、NMRスペクトルの計測・解析に着手する。上記の研究に加えて前年度までに実施した、IgGと補体やFcγ受容体などのエフェクター分子との相互作用研究を発展させ、得られた情報に基づいてエフェクター分子との結合能を向上させるための分子設計戦略の充実をはかる。
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