2019 Fiscal Year Annual Research Report
Clarifying left-right asymmetry by imaging of cell signaling and tissue development
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19H01022
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
望月 直樹 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究所長 (30311426)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 洋行 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (10467657)
迫 圭輔 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 上級研究員 (50786291)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | クッパ―胞 / 側板中胚葉 / 内胚葉 / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゼブラフィッシュの初期発生時の左右非対称性を誘導するクッパ―胞の形成は、内胚葉由来のSOX17 陽性細胞から構成されている。SOX17 陽性細胞は、SOX32 陽性内胚葉細胞からさらに転写活性がオンになることが知られている。
左右非対称性を生じる際に、クッパ―胞細胞が細胞自律性に貢献するのか？を検討するためにSOX17 陽性細胞の系譜を調べた。クッパ―胞は、胚の尾側で形成されるために、頭側で形成される心臓形成には貢献しないことは理解できるが、他の内胚葉臓器である膵臓や肝臓への左右差を有する臓器への分化は調べられていなかった。特にクッパ―胞細胞は一時的に形成され、繊毛を回転させ流れを作ることだけで、左右差を誘導する器官と考えられていたために、左右差のある臓器形成に直接かかわる自律的な役割は調べられていなかった。
Tg(sox17:KikGR) はphotoconversion前後で、SOX１７陽性細胞を蛍光色の相違で空間的に区別することが可能である。クッパ―胞細胞形成時期にphotoconversionしてその細胞が発生後期でいかなる組織構成細胞となっているかを調べた。SOX17 GFPはクッパ―胞内で限定的にphotoconversionが可能であり、SOX17 赤色蛍光細胞となり、この細胞群がのちにノトコードと体節となることがわかった。いずれも正中に局在する器官であり、SOX17陽性細胞が直接左右差のある臓器となることはなかった。今後は、より頭側側の膵臓や肝臓についても詳細に検討する必要があると考えられた。
BMP, Yap/Taz, Wnt シグナル可視化トランスジェニックフィッシュの作製は順調に進んでおり、側板中胚葉をモニターする個体も作製を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
左右非対称性を生じるメカニズムとして、クッパ―胞内のシグナルの左右差の相違とクッパ―胞の頭側に形成される中間組織（側板中胚葉細胞）のシグナルの左右差がまずあるのかをしらべるために、Wnt, BMP, Notch, Yap/Taz依存性の転写活性化がどこで起きるのか？DFCs, KV, PAM, LPM, 心筋前駆細胞 (cardiac precursor cells; CPCs)で活性化するのか？を明らかにすることを目指している。
このために、Tg(ベータアクチンプロモーター:TCF ベータカテニン結合部位/Gal4DBD);(UAS:EGFP),Tg(ベータアクチンプロモーター:Gal4DBD-hSmad4;(UAS:mCherry), Tg(promoter X:Gal4DBD-Tead N末端);(UAS:mTurquoise)を作成しつつある。また、それぞれのシグナルを欠損あるいは、優性劣勢変異体で抑制したときの表現型を調べることでこれらのシグナルの必要性を証明する。
これらのシグナル可視化ゼブラフィッシュを作成しながら、クッパ―胞細胞自身の左右差形成臓器校正細胞となるかを調べることで、自律的左右差形成細胞について調べた。本年度までに着実にシグナル可視化個体の作製が終わりつつあるので、このままシグナルを可視化するとともに、形態形成の左右差との因果関係を明らかにする準備ができていると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
内胚葉・中胚葉可視化動物を作製し、どの時点でどのような作用非対称性を生じるのかを観察できる個体を作製する。内胚葉はTg(sox32:EGFP) 中胚葉はTg(draculin:mCherry) を作製して、まず発生時のどの段階で内胚葉・中胚葉の左右差が生じるのかを検討する。
クッパ―胞内の繊毛の回転を実時間でイメージング可能かどうかの検討を行う。同時に、クッパ―胞内のCa2+ シグナル可視化を行えるかどうかを検討するために、Tg(arl13b:EGFP) とTg(sox17:GCaMP) を交配して、検証を行う。観察には、Dragonfly顕微鏡を用いて顕微鏡が観察に適当であるかどうかも検証する。
並行して、シグナル可視化動物として今年度はまずBMP シグナルの可視化により、左右非対称との関係の有無を調べるために組織特異的観察ラインとして 中胚葉組織特異的プロモーターとして、Draculinを使用する。このラインを使用することで中胚葉でのBMP シグナルの可視化が可能となる。Tg(draculin:Gal4DBD-hSmad4);(UAS:mCherry)を作製する。また、Tg－BREの観察を行うことで、生体のどの部位でのBREの活性化を生じるのかを発生早期で調べる。この両者のTgラインを調べることで、BMP シグナルと左右非対称性発生の相関をまず検討する。その後、 BMPの優性劣勢変異体の発現により左右非対称性が崩れるか否かを検討して、BMPシグナルと左右非対称性の因果関係を明らかにする。
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