2020 Fiscal Year Annual Research Report

AIDのRNA編集による抗体遺伝子多様化機構の解明

Research Project

Project/Area Number	19H01027
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	本庶佑京都大学, 高等研究院, 特別教授 (80090504)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小林牧京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20400690) Begum NasimAra 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (80362507)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	AID / RNA編集 / 免疫グロブリン遺伝子 / トポイソメラーゼ　１
Outline of Annual Research Achievements	SHM とCSR はActivation-induced cytidine deaminase (AID)によって触媒される。CSRはDNA 切断と断端修復との２つのステップから成るが、AID 自体はシチジン(C)をウリジン(U)に変換する脱アミノ酵素であり、DNA 切断や修復を直接担う訳ではない。DNA修復のステップには新たなタンパク合成が必要であるが、切断過程には必要ではない。このことから、我々はAID がDNA 切断と修復段階においてそれぞれmiRNA 及びmRNAのRNA 編集を行い、その結果DNA の切断と修復が行われるという仮説をたて、それに整合性のある知見を積み重ねてきた。今回、AID 依存的なmRNA 編集がESPN 転写産物中に起こることを確認した。この知見をさらに深め、DNA 修復過程の中で、AID による編集を受けたESPN RNA の翻訳産物がどのような仕組みを担うのかを明らかにする。また一方、DNA 切断においては、トポイソメラーゼ１（Top1）がDNA 切断に直接関わることを明らかにしてきた。AID がmiRNA を介してTop1 翻訳を制御しTop1 を低下させることがDNA 構造の変動を誘発し、さらに切断部位のnoncoding RNA (ncRNA)を編集する結果、Top1 による不可逆的なDNA 切断が起こると仮定している。この仮説を検証するため、AID 依存的なmiRNA 編集とAID 依存的なTop1 mRNA 結合性miRNA の同定を行い、ncRNA の編集を証明する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Top1 mRNAに結合するmiRNAを、RNA ligaseを用いた抗Ago2抗体を用いた免疫沈降法で同定を試みたところ、Top1 mRNAにTop1自身が結合し、二次構造を形成することがわかった。AIDによりTop1 mRNAがAgo2に結合する頻度は上がるため、AID活性化が何らかの理由でTop1 mRNAの高度の二次構造形成を促進し、その結果、翻訳抑制が起きると考えられた。Top1の3'UTRノックアウト細胞ではCSRやSHMが減少しており、AIDによる制御が3'UTRを介していると考えらえるが、二次構造形成は3'UTRに止まらず、3'UTRを発端にmRNA全体に広がっていた。抗体遺伝子切断に必要なhnRNP KのRNA結合ドメインの必要性を論文にまとめ発表した。現在も、hnRNP Kが必要なAID編集RNAを同定する研究を進めている。 AIDの高度DNA切断性を有する変異体JP8BdelとヒトB細胞株を用い、網羅的にAID依存的なRNA編集を検出する高速シーケンスをショートリード解析法で行った。情報解析の部分は学内で共同研究を行い、個々の遺伝子の結果を得た。それら候補遺伝子について今後CSRにおける機能を調べる。 AIDによる抗体多様化機構の一部として、本研究の前段階である基盤研究(S)（2015-2018年）で開始した抗体遺伝子切断領域に集積するタンパク質の解析（iChIP法）で同定したタンパク質SAMHD1について、細胞内dNTP濃度の制御を通じたDNA修復機構の成果を論文にまとめ発表した。さらにiChIP法で得られた、別の抗体遺伝子領域集積タンパク質候補XがAIDのC末端に結合し、DNA癒合段階に必要であること、さらにXに結合するタンパク質YもDNA癒合段階に必要なことが明らかになり、AIDのC末端を中心としたDNA癒合の分子機構が明らかになりつつある。
Strategy for Future Research Activity	Top1 mRNAがAIDの活性化後に二次構造を形成して翻訳抑制に至る過程についてさらに解析する。新たに内因性のAIDを抗AID抗体で相互作用因子をプールし質量分析で検索したところ、翻訳に関わる因子Zも認められたため、ZがTop1の翻訳抑制に関わるか否かを検討する。具体的にはAIDとZの結合を再確認し、Top1の翻訳抑制がZのノックダウンで解除されるか、Top1の3'UTRノックアウト細胞ではZのノックダウンが野生型と異なるか否か、などを解析し、Zの機能を明らかにする。Zの既知の機能からはZがAIDにより細胞質で隔離され、機能を発揮できない方向性もあり、そのような制御機構は実在すれば新しいものであり興味深い。網羅的なAIDによるRNA編集解析の結果、得られた候補因子の機能をノックダウン法により調べる。情報解析が容易な遺伝子領域を見る限り、AIDに依存したC to U編集の頻度は高くなかった。ショートリードでは反復配列やレトロトランスポゾンなどのマッピングが困難な配列は解析不能である。抗体遺伝子に特有のncRNAが反復配列を1 kbにわたり有していることから、これらも解析対象にするよう、ロングリード解析を行う予定である。 hnRNP Kが結合するmRNAやnoncodingRNAの他、hnRNP Kにより制御されるRNA分子を明らかにし、それらの候補の中からオーバーラップするものを得て、AIDによる編集ターゲットが含まれていないか、検索をする。 AIDのC末端を中心としたDNA癒合の分子機構を明らかにするために、XやYが複合体を成しているか、それらがどのような機能を持つのか、についてさらに追求する。