2019 Fiscal Year Annual Research Report
Quantitative Meta-barcoding for Rapid and Accurate Assessment of Species Diversity: Application to Community and eDNA samples
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19H02276
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
渡辺 幸三 愛媛大学, 沿岸環境科学研究センター, 教授 (80634435)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 幹男 大阪府立大学, 高等教育推進機構, 教授 (30204499)
竹門 康弘 京都大学, 防災研究所, 准教授 (50222104)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メタバーコーディング / 河川 / 底生動物 / 環境DNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【項目１ DNAデータベースの超高速拡充】申請者らが保管する昆虫標本を使って，DNAバーコーディングに良く用いられるマーカーの配列を解読した。研究初年度となる本年度は生物試料とその塩基配列データ（18S rRNA、ヒストンH3、ミトコンドリアCOI）を整理した。現時点までに収集した試料についてはウエブサイトに公開した（ http://www.b.s.osakafu-u.ac.jp/~mkato/J-amir_home.htm ）。また，各マーカーを増幅するPCRプライマーに各標本を標識する人工配列を付加するための実験プロトコルの最適化に成功した。
【項目２ 定量DNAメタバーコーディング法の開発】リアルタイムPCRの原理を応用して， 深度の増殖曲線（PCRサイクル数と深度の関係）を定式化することで，鋳型DNA中の各配列型の初期頻度（∝相対個体数・相対重量）を推定する技術開発に着手した。まず，PCRを12段階のPCRサイクル数（20，24，28，・・・，56，60，64 ）で行った。この際，各サイクル数の認識コード配列（6塩基）をプライマーに付加して，解読される各DNA配列のサイクル数を認識した。そして，Operationa Taxonomic Unit (OTU）ごとに深度の増殖曲線式を推定して，初期鋳型DNA中の各配列型の初期頻度を推定した結果，OTUによっては高い精度で推定できたが，そうではないものもあった。
【項目３ 砂州を活用した効率的な環境DNA回収技術の開発】天竜川中流域に分布する３つの砂州を選び，各砂州の上流端（伏流地点），下流端（湧水地点），砂州中央部の３地点において河床間隙水と河床材料を３サンプルずつ採取した。採取したサンプルからそれぞれ環境DNAを抽出して濃度定量した。そして，環境DNA（河床，表層水）と群集DNAのメタバーコーディング解析を行うためのDNAライブラリーを作成し，MiseqによるDNA配列データの解読を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究項目１，２，３で予定していた研究計画を概ね実施することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
項目２（定量DNAメタバーコーディング法の開発）で進めている初期鋳型DNA量の推定精度が悪い種が多いため，PCR条件の最適化や複数マーカーを組み合わせた時の精度改善効果を検証していく必要がある。
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Research Products
(20 results)
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[Journal Article] A Remarkable New Genus and Species of Nemourinae (Plecoptera, Nemouridae) from Sichuan, China, with Systematic Notes on the Related Genera2020
Author(s)
Mo, R-R., M Gamboa, K. Watanabe, G-Q Wang, W-H Li, D Yang, D Muranyi
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Journal Title
PLoS ONE
Volume: 15(3)
Pages: e0229120
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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