2021 Fiscal Year Annual Research Report
長鎖クモ糸タンパク質遺伝子の利用による高強度シルクの創出
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19H02528
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Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
Principal Investigator |
小島 桂 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (40370655)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | 遺伝子組換えカイコ / クモ糸シルク / オニグモ |
Outline of Annual Research Achievements |
本年度は当初計画に従って、まず茨城県つくば市においてオニグモ(Araneus ventricosus)成体を屋外採取し、糸腺組織を採取してmRNA調整ののち縦糸タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写し、最適化したSMART法にしたがって、テンプレートスイッチから2nd strand cDNA合成したのち、In-Fusion法により発現ベクターへのcDNAのディレクショナルクローニングを行った。なお、逆転写プライマー及びTSOは昨年度設計した中から最適なものを使用した。cDNAクローニングから、コロニーハイブリダイゼーションによるクモ糸タンパク質遺伝子を含むクローンの選抜を繰り返し、得られたクローンの得られたクローンのうち、長鎖のものから順にナノポアシーケンサによる配列確認を行い、タンパク質遺伝子として問題無い配列の選抜を行った。配列としては、より長鎖のものもあったが、フレームシフトやキメラ配列と思われるcDNAクローンを排除して、最終的にMaSp1(2.5kbp)、MaSp2(8.6kbp)、MaSp3(4.7kbp)、Flag(4.1kbp)の4クローンを選抜した。これらについて、カイコ組換えベクターの構築を行い、カイコに遺伝子導入を行った。現在系統化を進めている。 コガネグモについても同様に採取・mRNA 調製を行い報告がある配列を元にSMART報によるクモ糸タンパク質遺伝子のクローニングを試みた。その結果、縦糸タンパク質と思われるクローン(1kbp)1クローンの取得に成功した。コガネグモcDNAの取得については、得られた配列の解析を元にクローニング手法のブラッシュアップを行い、より長鎖のcDNAクローニングにつなげる予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね計画通りに研究を遂行した。 一方、遺伝子クローニングに難航して、目的長のcDNA取得に至らなかったクローンがあった。しかしながら、解析に必要と考えている程度のクローンの取得には成功しており、実質的に問題は無いと思われる。
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Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通りに研究を進める。 ただし、オニグモcDNAの取得が不十分なところもあるので、他のクモ類の優先順位を下げてオニグモのcDNAクローニングと遺伝子組換えカイコの作出・解析で成果を出すことを優先する。
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