2020 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロ/ナノ空間の電気化学的pH制御技術の開発と細胞内ATP合成制御への応用
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19H02577
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
三宅 丈雄 早稲田大学, 理工学術院(情報生産システム研究科・センター), 准教授 (50551529)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 善浩 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10223843)
三留 規誉 常葉大学, 教育学部, 准教授 (90431981)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオプロトニクス / pH制御 / ATP合成酵素 / ミトコンドリア / 電気化学計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，4年で完成させる計画を立てており，初年度(2019年度)においては，申請者が独自開発したpH制御有機電極のマイクロパターニングおよび性能向上に取り組む．2020－2021年度においては，マイクロ有機電極上に研究分担者が独自開発したATP合成酵素を含む脂質二分子膜を形成し，ナノ間隙内pHを電気化学的に制御することでATP合成制御を実現させる．2022－2023年度において，櫛型マイクロ有機電極上で細胞を培養し，プロトン刺激によってマイクロスケールの細胞内ミトコンドリアからのATP合成を制御することで，完成させる。2020年度において、以下に示す3項目の開発に成功した。
1.1pH制御有機電極のマイクロパターニングおよび性能向上
本研究では、脂質二分子膜を形成するための電極平坦性に加え，ATP分解に伴うプロトン抽出(外から内)とATP合成を誘発するプロトン注入(内から外)を電気化学的にスルホン化ポリアニリン(SPA)電極で制御する微小空間(ナノ間隙：SPA電極とATP合成酵素包含二分子膜)・微小電流制御システムを開発した。
2.1電気化学式pH制御による細胞膜ATP合成酵素機能の制御：電気化学式pH制御電極上への脂質二分子膜のベシクル展開およびATP合成酵素機能のプロトン計測および刺激制御
3.1電気化学式pH制御による細胞内ATP合成制御：電気化学式pH制御電極上への細胞接着および細胞内ミトコンドリアにおけるPH制御
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はコロナウィルスの影響で実験室にて取り組む作業時間や人数などに制限があった。しかしながら、初年度の大きな進展があったため、今年度は計画通り2.1(2020-2021年度)に必要なデータを取得することができ、成果論文を投稿することに成功したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、2.1「電気化学式pH制御による細胞膜ATP合成酵素機能の制御」を完成させ、論文としてまとめることを主たる目的とし、さらに、3.1「電気化学式pH制御による細胞内ATP合成制御」にも取り組む。
具体的には、研究分担者によって開発されたATP合成酵素を含むリン脂質でベシクル溶液を作製し、SPAマイクロ電極上にベシクル展開する。この際、有機電極上に膜を単層で展開させるための振盪強度や溶液濃度の調整を行う。ATPの加水分解によってバルク溶液中からSPA有機電極へ流れ込むプロトン流を発生させ、リン脂質膜とSPA電極のナノ間隙におけるpH計測に加え、プロトン電流を計測する。これにより膜内外におけるプロトン濃度勾配を把握し、さらに負電圧の印加によって生じるプロトン電流(プロトンの抽出)を計測することでATP合成酵素の活性を評価する。一方、電圧を正に印加するとSPAからナノ間隙へプロトンが注入され、それに伴う膜内外のプロトン濃度勾配の発生により合成されるATP濃度を計測することで、リン脂質膜に存在するATP合成酵素機能を制御する。
さらに、細胞をSPA有機電極上に接着させるための評価を行う。細胞を接着させるための前処理として、UV照射による滅菌処理と接着を促進させる接着分子(コラーゲン)の塗布が必要となる。本研究では、電極上で細胞を培養し、ミトコンドリア機能に変化がないことを蛍光評価する。
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