2021 Fiscal Year Annual Research Report
マイクロ/ナノ空間の電気化学的pH制御技術の開発と細胞内ATP合成制御への応用
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19H02577
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
三宅 丈雄 早稲田大学, 理工学術院(情報生産システム研究科・センター), 教授 (50551529)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 善浩 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10223843)
三留 規誉 常葉大学, 教育学部, 准教授 (90431981)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バイオプロトニクス / pH制御 / ATP合成酵素 / ミトコンドリア / 電気化学計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，研究者らがこれまでに開発してきた水素イオンと親和性の高い有機Protode電極を利用し，その近傍に好熱菌由来ATP合成酵素を含むリポソーム，あるいは，ATP合成活性の高いブタ心臓由来の心筋細胞中ミトコンドリアを設置することで，ATP合成酵素によるATP合成機能を包括的に評価し(酵素分子レベルから細胞内レベルにおいて理解)，デバイスによってプロトン駆動力を制御し、ひいてはATP合成を制御できるインタラクティブバイオ界面を構築することを研究目的とする．
上記課題は，4年で完成させる計画を立てており，初年度(2019年度)においては，申請者が独自開発したpH制御有機電極のマイクロパターニングおよび性能向上に取り組む．2019－2020年度においては，マイクロ有機電極上に研究分担者が独自開発したATP合成酵素を含む脂質二分子膜を形成し，ナノ間隙内pHを電気化学的に制御することでATP合成制御を実現させる．2021－2022年度において，櫛型マイクロ有機電極上で細胞を培養し，プロトン刺激によってマイクロスケールの細胞内ミトコンドリアからのATP合成を制御することで，完成させる。
2021年度において、以下に示す3項目の開発に成功した。2.1電気化学式pH制御による細胞膜ATP合成酵素機能の制御：①電気化学式pH制御電極上への脂質二分子膜のベシクル展開，②ATP合成酵素機能のプロトン計測および刺激制御，3.1電気化学式pH制御による細胞内ATP合成制御：①電気化学式pH制御電極上への細胞接着，②細胞内ミトコンドリアにおけるPH制御，③細胞内pH制御による機能解析
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は，当初の計画(2021-2022年度)より早く研究成果をあげることができ，現在，学術論文を投稿中である．一方，昨年から取り組んでいる研究課題2.1に関する成果をまとめ，学術論文誌に採択される成果を得た．
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，3.1「電気化学式pH制御による細胞内ATP合成制御」を中心に取り組み，さらに，2.1「電気化学式pH制御による細胞膜ATP合成酵素機能の制御」に関して，プロトン以外のキャリアでATP合成を実現する取り組みにも挑戦する．
具体的には、細胞をSPA有機電極上に接着させるための評価を行う．細胞を接着させるための前処理として，UV照射による滅菌処理と接着を促進させる接着分子(コラーゲン)の塗布が必要となる．事前の調査では，UV照射を24時間有機電極に照射およびコラーゲンを被覆しても電極性能に影響がないことを確かめた．本研究では，電極上で細胞を培養し，ミトコンドリア機能に変化がないことを蛍光評価する．
さらに，SPA有機電極によるプロトン刺激によって細胞内ミトコンドリアで生じるATP合成と活性酸素の定量的な解析を行う．事前の調査では，溶液中pHを変化させることで細胞内pHが変わることを確かめてある．また研究協力者が取り扱う接着性細胞(C6 or Hela)には，遺伝子組み換えによって蛍光プローブ(GO-ATeam)が発現しており，これにより細胞内のATP濃度を蛍光強度から直接計測可能となる．活性酸素の評価は，市販のMitosox redを用いて蛍光による評価を行う．ミトコンドリアによるATP合成は，pHが低い場合に生じ，活性酸素の生成は，pHが高い場合と異なる．これら分子は細胞内シグナルとして利用されるため，生成濃度を制御することは重要な技術となる．
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