2019 Fiscal Year Annual Research Report
機能発現・判別を指向するDNAアプタマーの電気泳動選抜
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19H02740
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
齋藤 伸吾 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60343018)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
半田 友衣子 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (20586599)
吉本 敬太郎 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (60392172)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DNAアプタマー / キャピラリー電気泳動 / 次世代シーケンシング / 分子認識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，DNAアプタマー（分子認識する一本鎖DNA）の認識能が様々な分野で注目されている。既存のアプタマー獲得法では，ランダムDNAライブラリーから選抜操作を繰り返してアプタマー配列が得られるが，DNAアプタマーの性能の判別や機能の選抜はできない。また，高性能なアプタマーを取り逃がしている可能性が高い。本研究では，キャピラリー電気泳動法の高分離能と次世代シーケンサーの配列決定能を組み合わせ，わずか１回の選抜操作での高速なアプタマー選抜を達成することを目指す。また，得られた大規模な配列情報から選択則に基づいてアプタマー配列を判別し，アプタマーの取り逃がしなく，性能予測をし，かつデータベース化できる新規手法（SR-CE選抜法）を確立する。
一年目である令和元年度は，高分離能を有するキャピラリー電気泳動（CE）で分離したターゲット（タンパク質や細胞）－DNA複合体分画を回収し，これに次世代シーケンサー（NGS）による大規模解析を組み合わせ，１ラウンドで高速に再現性のあるDNAアプタマー選抜ができ，配列解析からアプタマー配列が判別できるかの実証実験を行った。また，SR-CE選抜の基礎技術となる，2点間検出-CE装置を用いる濃縮-分離-精密分取法について，その精度と正確さについても評価した（Electrophoresis, 印刷中）。その結果，CEによる濃縮-分離-分取技術はアプタマー選抜に用いるために十分な精度を有すること，および1ラウンドでのトロンビン結合型DNAアプタマーの獲得および配列からのアプタマーの判別が可能であることが実証された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画通りに令和元年度は，SR-CE選抜が可能であるかの実証実験を行った。血液凝固因子であるトロンビンタンパク質に対してSR=CE選抜を行い，その次世代シーケンシング（NGS）と配列情報の整列解析によってアプタマー配列を見分けることに成功した。また，得られたNGS配列情報には，既報のDNAアプタマーの配列の多くが含まれており，高性能DNAアプタマーの取り逃がしの少ない有用な手法であることが明らかとなった。2回のSR-CE選抜で類似の配列が選抜され，2回の選抜でその類似配列数の序列に相関があったことから，再現性のある選抜であることも明らかとなった。
さらに，SR-CE選抜法での基盤技術である2点間検出-CE装置によるオンキャピラリーでの選抜試料の濃縮-分離-精密分取を試み，分離したピーク形状通りの分取が可能であることを実証した。この技術はSR-CE選抜時で使用するだけでなく，試料に添加するランダムDNAライブラリーの精製にも用いており，重要な基礎技術である。
以上の通り，研究計画通りに順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は研究計画通りに次世代シーケンシング（NGS）によって得られた配列情報中のアプタマー配列の数とその性能（結合能）に相関があるかを検証する。そのために多くのアプタマー配列の結合実験を行う必要がある。さらに，ランダムDNAライブラリーを分子ふるいCEによってDNA分子の形状によって分割しサブライブラリーを調製する。そのサブライブラリーを用いて，高次構造を形成するDNAアプタマーと標的物質と結合することで高次構造を誘起するDNAアプタマーがそれぞれ獲得できるかを検証する。また，得られたNGS結果をアプタマーデータベースとして利用し，データベース比較から特異的なDNAアプタマーが得られるかを検証する予定である。
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