2019 Fiscal Year Annual Research Report
ラマン分光を用いた非侵襲生細胞温度分布可視化法の開発
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19H02744
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
島田 林太郎 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任助教 (70548940)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ラマン分光 / 温度計測 / 分光画像計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体分子そのものから発生するラマン散乱光をもとに、プローブ分子などを用いず、非侵襲的に細胞内物質の温度を直接計測する新たな細胞内部温度可視化手法の開発のため、本年度は温度分布計測法と可視化(イメージング)法を組み合わせる要素技術の確立を行った。
顕微ラマン分光計開発として、まず、特殊な光学フィルター（体積ブラッグ回折格子フィルター）を装置に加え、装置測定領域を短波長領域まで拡張した。拡張された測定領域から得られたデータをボルツマン分布則に従い解析することで、5秒露光のラマンスペクトルから±3 Kの精度で温度を計測できることを確認した。今後、測定光学系の感度向上や解析手法の改善によるノイズ軽減などにより露光時間の短縮化および温度精度の向上を検討する。
次に、作成した温度計測法と、研究代表者らが考案・開発してきた「多点並列検出ラマン顕微分光画像計測法」を組み合わせ、高速ラマン分光画像温度計測装置を構築した。体積ブラッグ回折格子フィルターの配置を高速ラマン分光画像計測に最適化するため、複数通りの光学素子配置を比較検討し、もっともスペクトル検出感度が高い配置を決定した。光学系の比較検討に合わせ、次年度に計画している「励起波長高速変調ラマン分光計測」と組み合わせるための分岐光学系を設計、設置し基礎的な分光性能の確認及び最適化を行った。開発した装置を温度制御された標準試料に適用し、温度計測の分解能、確度などを評価し、当初の想定どおり、試料由来の蛍光背景光が温度計測確度を悪くする顕著な妨害要因であることを確認した。これについては次年度、励起波長高速変調ラマン分光計測を適用することにより蛍光信号の客観的、自動的な排除に取り組む。
励起波長変調ラマン分光法に関して時間変動のある蛍光背景光の除去能の検討を行い、その結果をJ. Biophotonics誌にて報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画では、分子が振動基底状態から振動励起状態に遷移する「ストークスラマン散乱」と振動励起状態から振動基底状態に遷移する「アンチストークスラマン散乱」を同一から同時に計測し、それらの信号強度比から対象物の絶対温度を求めるラマン温度計測法と、研究代表者らが考案・開発してきた「多点並列検出ラマン顕微分光画像計測法」との組み合わせの実証的検証を最重要の課題としていた。特殊な光学フィルター（体積ブラッグ回折格子フィルター）の導入により、通常の単焦点ラマン顕微鏡においてはストークスおよびアンチストークスラマン散乱が同時計測できることは知られていたが、多点並列検出ラマン顕微分光画像計測装置でも同様の性能を発揮できるかは未知な部分が多かった。実際の装置を構築し光学配置を詳しく検討することによりにより、多点並列検出ラマン顕微分光画像計測装置でもラマン温度計測が可能なことを実証的に示すことができ、当初の目標は概ね達成できたと考える。実際に装置を構築することにより明らかとなった温度計測の精度・感度・確度を制約する要因も概ね研究開始前に想定していた通りでああったため、次年度以降の装置開発により対応できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の研究により、試料由来の蛍光背景光が温度計測確度を悪くする顕著な妨害要因であることを確認した。この問題を回避するために、2020年度は当初の予定通り「励起波長高速変調ラマン分光法」を中核技術とし自家蛍光とラマン信号光を厳密に分離する手法の開発を行い、その性能評価や生細胞への応用・検証を実施する。
既設の多点並列検出ラマン顕微分光計に、励起波長を高速変調する励起光学系を導入し、励起波長高速変調ラマン分光計測すなわち温度計測の多点化を行う。励起波長変調と空間点掃引を同時に行い、それら二変数の変調成分を2つの二次元検出器を用い、分離して検出する。当初の研究計画では二次元ロックインカメラを検出器として用い、波長変調成分を時間変調成分として、空間掃引成分は検出器画素上の空間(検出素子の位置)成分として分離して検出を行う装置を構築する予定であったが、ロックインカメラの検出感度が温度計測に適さないことが昨年度の実験により明らかになったため予定を変更する。２つの二次元検出器を並行して作動させることにより波長変調成分と空間掃引成分を分離した検出機構の開発を行う。生細胞における温度計測に必要な要素技術の開発を本年度で達成する予定である。
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