2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H02825
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
高谷 直樹 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50282322)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 糸状菌 / サーチュイン / ヒストン / 脱アセチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物の二次代謝産物には、医農薬を含む生物活性物質などの有用化合物が多く知られている。これを支える多様な二次代謝系研究には広範な微生物種の探索研究も重要であるが、通常は発現していない潜在的な二次代謝系を人為的に発現させることも重要である。近年、糸状菌の多くの二次代謝系の発現はエピジェネティック抑制を受けていることが判明してきた。本研究では、遺伝子のエピジェネティクス発現制御に関わるサーチュイン（糸状菌由来）の阻害機能を持つ化合物を探索・精製し、汎用型の二次代謝系発現誘引物質（糸状菌用）として利用することを目指している。これまでに、糸状菌Aspergillus nidulansでは、サーチュインの阻害によりヒストンのアセチル化レベルが増加し、二次代謝系遺伝子の活性化が起こることを明らかとした。また、本菌のゲノム配列から推定される5種のサーチュイン（SirA～SirE）に対する各種の分子生物学・生化学的解析によって、SirCとSirDによるヒストンH3のK18とK56部位の脱アセチル化が二次代謝系の発現抑制に大きく影響することを解明した。そこで、糸状菌の二次代謝系遺伝子発現を抑制するアイソザイムとしてA. nidulansのSirCとSirDを選抜した。さらに、これらの組換え酵素の調製、この活性の阻害を指標に、複数の糸状菌培養抽出物をスクリーニング源として天然物をスクリーニングする手法を確立した。また、この手法を用いてスクリーニングを開始するという成果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）ターゲットとなるサーチュインアイソザイムの選定：A. nidulansの5種のサーチュイン（SirA～SirE）のうち、二次代謝系の発現抑制に関わるものを選抜した。具体的には、それぞれの遺伝子破壊株を作製し、HPLCを用いた二次代謝産物の発現プロファイルの解明、核画分のWestern blot解析によるヒストンアセチル化レベルの測定、トランスクリプトーム解析を行う。これらの結果を総合し、最も強く広範な二次代謝系遺伝子発現を抑制するアイソザイムを選抜する。この際、これまでアセチル化が確認されているH4K16（ヒストンH4のLysine 16残基、以下同様に表記）, H3K9, H3K18, H3K56をアセチル化ヒストンの解析のターゲットとした。また、各アイソザイムの組換え酵素を大腸菌を用いて調製し、各種アセチル化ペプチドに対する活性を測定し、HDA活性の阻害化合物のスクリーニングに用いるアイソザイムとして、SirCとSirDを選抜した。
（２）二次代謝系発現誘引物質の一次スクリーニング：SirCとSirDの組換え酵素のHDA活性をハイスループットで測定する系を構築できた。哺乳類のサーチュインの阻害剤の探索のために各社から蛍光色素の放出によって384穴プレートを用いて多検体処理可能なキットが市販されている。この数種の中からSirCとSirDによるH3K18とH3K56部位の脱アセチル化の測定に適したものを選抜できた。さらに、反応時間、使用するカビ培養抽出液等を検討し、スクリーニング条件を最適化した。得られた系を用いて、SirCおよびSirDの活性の阻害を指標に、カビ100種の培養液の培養抽出物をスクリーニング源として天然物をスクリーニングを開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、この組換え酵素の活性の阻害と活性化を指標に、糸状菌培養抽出物をスクリーニング源として天然物をスクリーニングする。候補化合物を精製・構造決定し、汎用型の二次代謝系発現誘引物質として利用することを目指す。具体的には、得られた候補化合物の反応液をHPLCに供し、SirCおよびSirDの反応産物であるニコチンアミドおよび脱アセチル化されたペプチドの生成を指標に阻害化合物を絞り込む。候補化合物について、培養のスケールアップにより候補化合物を含む抽出物を大量調製し、A. nidulansなど数種の糸状菌の培養に添加し、二次代謝産物生産の活性化能をもつものを選抜する。数種の化合物を選定し、常法に従い阻害化合物の生産菌の大量培養と阻害化合物の精製を行う。また、常法に従い、質量分析と各種NMRを用いて構造を開始する。最低でも、SirCおよびSirDの活性阻害の能力を持つ1種の化合物を特定することを目標にする。大量調製が容易かつ活性の高い化合物が得られたら、当該化合物を添加した条件下で複数の糸状菌を培養することで、通常発現していない二次代謝系が覚醒された培養抽出物ライブラリーの調製を行うことを目指す。
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