2019 Fiscal Year Annual Research Report
化学修飾ペプチドファージライブラリを駆使した標的指向型ペプチド創薬基盤の確立
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19H02838
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
三原 久和 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (30183966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堤 浩 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (70398105)
三木 卓幸 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20823991)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ペプチド / ファージ提示 / 薬剤複合体 / タンパク質相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体代替分子（医薬品）の開発が求められる中、ファージディスプレイ法などの大規模ライブラリを利用した中分子ペプチド創薬が注目されている。本研究では、化学修飾により低分子薬剤などを複合化したペプチドファージライブラリを駆使することにより、低分子薬剤のタンパク質活性中心指向性とペプチドのタンパク質表面認識特性を合わせもつ薬剤-ペプチド複合体（Drug-Peptide Conjugate：D-PeC）の獲得を実施することを目的とした。
これまでに、M13ファージの一種で外殻タンパク質pIIIにシステイン残基をもたない変異型fdファージを利用し、化学修飾が可能な設計ペプチドライブラリとしてヘリックスおよびループペプチドライブラリを構築している。本年度は、環状ペプチドおよびStapledペプチドライブラリの構築を行った。ペプチドライブラリをコードしたファージベクターを遺伝子工学的に調製し、大腸菌TG1株に形質転換・培養した後、培養上清からファージを精製した。形質転換効率とDNA配列解析から、構築したライブラリがスクリーニングに十分な多様性をもつことを明らかにした。調製したファージライブラリに、別途、有機合成した低分子薬剤誘導体を反応させ、低分子薬剤修飾ペプチドファージライブラリの構築を行った。種々の条件検討の結果、ファージ上に提示したペプチドライブラリを選択的かつ高効率で修飾する条件を見出すことができた。また、標的タンパク質の調製も行った。研究の繰り越しを行ったが、計画を予定通り遂行した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和1年度は、ペプチドファージライブラリの調製、低分子薬剤誘導体の合成と低分子薬剤修飾ペプチドファージライブラリの構築、および標的タンパク質の調製を計画していた。環状ペプチドファージライブラリについては、XXX-C-XXXXXX-C-XXX（Xはランダムアミノ酸）の配列をもつペプチドライブラリの調製を検討していたが、調製したライブラリの多様性が理論的な値と比較して低いが、ライブラリの多様性自体は108程度と十分に大きい値であったため、スクリーニングに使用できると判断した。Stapledペプチドライブラリについては、理論的な配列多様性を十分にカバーするファージライブラリを調製することができた。
低分子薬剤誘導体として、ガラクトース誘導体、スルホンアミド誘導体、ヒドロキサム酸誘導体、架橋剤誘導体を合成した。ペプチドライブラリ内に配置したシステイン側鎖のチオール基と選択的に反応させるため、ブロモアセチル基またはブロモベンジル基をもつ誘導体を設計し、問題なく合成することができた。
調製したペプチドファージライブラリに対して低分子薬剤誘導体を反応させ、低分子薬剤修飾ペプチドファージライブラリの構築について検討を行った。低分子薬剤誘導体の溶解性を改善するために、緩衝液に有機溶剤を添加する必要が生じた。また、ファージ上に提示したペプチドに対して高効率で低分子薬剤を修飾させるために、緩衝液pHや反応温度等について種々の条件検討の結果、反応条件を最適化することができた。最適化した条件をもとに、低分子薬剤修飾ペプチドファージライブラリの構築を実施した。
当初、計画していた予定のうち、上記反応条件の最適化や標的タンパク質の調製も完了し、概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和1年度から進行させている低分子薬剤修飾ペプチドファージライブラリの構築を完遂する。また、標的タンパク質の調製を実施し、タンパク質の活性を確認する。
令和1年度の研究計画を完遂した後、令和2年度に計画している「標的タンパク質に特異的な低分子薬剤修飾ペプチド（Drug-peptide conjugate: DPeC）のスクリーニング」を実施する。標的タンパク質として、炭酸脱水酵素、ガレクチン3などを用い、スクリーニング条件の最適化を行う。順調にスクリーニングが実施できる標的タンパク質については、スクリーニング後のファージプールからクローニングとDNA配列解析を実施し、特定のペプチド配列が濃縮されているかを確認する。また、クローニングしたファージを用いたELISA実験を行い、合成対象となる候補ペプチドの選別を行う。
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