2019 Fiscal Year Annual Research Report
代理リガンドの創製によるLDL受容体ファミリーのメンブレントラフィック機構の解明
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19H02841
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
安井 典久 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (90467514)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 進化分子工学 / 代理リガンド / 人工タンパク質 / エンドサイトーシス / LDL受容体 / ファージディスプレイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度において，研究代表者らが独自に開発した一本鎖モネリンを分子骨格とする人工タンパク質のファージディスプレイライブラリーの高度化と選別の最適化に取り組んだ。このファージディスプレイライブラリーの選別により，任意の標的に結合する人工タンパク質を作製することができる。新しく構築したファージディスプレイライブラリーについて，モデルの標的タンパク質であるgreen fluorescent protein (GFP) およびyeast small ubiquitin-like modifier (ySUMO) に対する選別を実施し，ライブラリーの評価を行った。その結果，それぞれのモデル標的に結合する人工タンパク質が得られ，前世代のライブラリーで得られた人工タンパク質よりも，数倍から8倍程度，親和性が高かった。したがって，一本鎖モネリンのファージディスプレイライブラリーの品質を向上させることに成功した。ファージディスプレイ系では，親和性の高いクローンを定量的に選別することが難しいという欠点がある。一方で，酵母ディスプレイ系では，蛍光活性化セルソーティングの利用により，定量的なライブラリー選別が可能である。そこで，一本鎖モネリンの酵母ディスプレイ系の構築に取り組んだ。ファージディスプレイライブラリーの選別で得られたGFPに親和性を示す一本鎖モネリン変異体について，酵母細胞表層への提示とGFPへの結合を確認できた。なお，この確認にあたり，簡易型フローサイトメーターを導入し，活用した。
上記の研究と並行して，low-density lipoprotein (LDL) 受容体の細胞外領域断片の組換えタンパク質の生産に取り組んだ。培養細胞系のスケールアップに検討を要したが，最終的にExpi293F細胞の高密度振とう培養系を利用することで大量発現できる目処がたった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
一本鎖モネリンのコンビナトリアルライブラリーの改善に成功した他，酵母ディスプレイ系の構築に着手することができたことから，LDL受容体の代理リガンド作製の基盤となる一本鎖モネリンを分子骨格とする人工タンパク質の作製基盤の構築に目処がたった。一方で，LDL受容体細胞外領域断片の組換えタンパク質大量発現系の確立に予想していたよりも時間を要したため，当初目標としていたLDL受容体細胞外領域に結合する一本鎖モネリン変異体の取得にとりかかることができなかった。以上のことから，上記のような進捗状況であると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
LDL受容体の細胞外領域断片の組換えタンパク質について,大量発現系を確立できたので，直ちに精製を実施し，精製サンプルをファージディスプレイライブラリーの選別に供する。また，ライブラリーの選別や得られた個別の一本鎖モネリン変異体の標的タンパク質への親和性測定に酵母ディプレイ系も利用する。
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