代理リガンドの創製によるLDL受容体ファミリーのメンブレントラフィック機構の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02841
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 安井 典久 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (90467514)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 進化分子工学 / 代理リガンド / 人工タンパク質 / エンドサイトーシス / LDL受容体 / 一本鎖モネリン / 分子骨格 / ファージディスプレイ

Outline of Annual Research Achievements

当初の研究目的および研究計画に従い，Low-density lipoprotein (LDL) 受容体の代理リガンドの作製に引き続き取り組んだ。まず，昨年度に得られていた一本鎖モネリン (scMonellin) を分子骨格とし，LDL receptor type A (LA) moduleに結合する人工結合タンパク質について，結晶構造解析に取り組んだ。その結果，結晶構造の決定に成功した。結晶構造解析の結果，scMonellin変異体によるLA moduleの認識機構を明らかにすることができ，新しいコンビナトリアルライブラリーの設計へとつながる構造情報を得ることができた。
LDL受容体の各ドメインとscMonellin変異体の相互作用解析について，これまではELISA法とゲルろ過クロマトグラフィーを実施するに留まっていた。すなわち，相互作用の解離定数を見積もることができていなかった。そこで今年度，新しい結合解析系として，酵母表層提示法 (yeast surface display法) を利用した実験系を構築し，解離定数を見積もることが可能な定量的な結合解析を実施できる体制を整えることができた。この方法は，スループットも高く，今後の研究の進展を加速するものと考えられる。
また，実施が遅れているLDL受容体のエンドサイトーシスを解析するために，ヒト肝癌由来細胞株HepG2細胞を入手し，培養を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

結晶構造解析や結合解析系の構築に成功し，大きく研究は進展した。一方で，人工結合タンパク質によるLDL受容体のエンドサイトーシスへの影響を調べる研究で遅れが生じているため，上記の進捗状況であると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

引き続き，LDL受容体ファミリー群の細胞外領域を構成する各ドメインに対し特異的に結合するタンパク質性の代理リガンドを網羅的に作製する。タンパク質性代理リガンドの作製には，進化分子工学の手法を用いる。具体的には，研究代表者が構築した一本鎖モネリンを分子骨格とするコンビナトリアルライブラリを利用する (Yasui et al., J Biochem. 2021)。LDL受容体ファミリー群の細胞外領域を構成する各ドメインの組換えタンパク質調製とLDL受容体ファミリー群の各ドメインに結合する代理リガンドの候補となる人工タンパク質の選別については，順調に実施する目処がたっている。そこで，代理リガンドがLDL受容体ファミリータンパク質のメンブレントラフィック機構に及ぼす影響を調べるために必要な実験系 (培養細胞を用いた蛍光免疫染色) の構築を重点的に進める。