2020 Fiscal Year Annual Research Report
糖鎖シャペロンによる疎水性タンパク質認識の機構解明
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19H02843
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| Research Institution | Suntory Foundation for Life Sciences |
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Principal Investigator |
島本 啓子 公益財団法人サントリー生命科学財団, 生物有機科学研究所・構造生命科学研究部, 主幹研究員 (70235638)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 糖脂質 / 疎水性タンパク質 / 相互作用 / シャペロン / 凝集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの膜タンパク質は疎水性に富んだ膜貫通領域を持っており、この部分で凝集しやすいため、膜に挿入するためにはSecトランスロコンと呼ばれる膜透過チャネルが必要である。しかし、膜貫通部位を１つもしくは２つしか含まずC端が短い膜タンパ ク質の場合は、Secトランスロコンを必要としない（トランスロコン非依存的膜挿入）。我々は、すべての経路に必須の膜挿入因子としてMPIaseを見出した。 MPIaseは３種類のアミノ糖ユニットの繰り返しからなる糖鎖構造(n=9-11)と脂質部がピロリン酸を介して結合している。 我々は昨年度までに、MPIaseの最小活性構造(mini-MPIase-3)およびその類縁体を合成し、SPR (表面プラズモン共鳴)を用いた速度論的な解析を行ってきた。本年度も引き続き、合成類縁体についてSPRによる相互作用を測定した。また、タンパク質側の変異体を用いたSPR実験により、疎水性アミノ酸配列やC端側塩基性アミノ酸残基とMPIaseが相互作用していることを実証した。分子計算により、リン酸化糖鎖とタンパク質のアミノ酸残基ごとの接触頻度を求め、実験結果と同様に、疎水性アミノ酸配列やC端側塩基性アミノ酸残基での相互作用確率が高いことを示した。CDやDLSの結果から、疎水性タンパク質とMPIaseを混合すると、可溶性の複合体が生成する結果を得ているが、現在用いている基質タンパク質は溶解度が著しく悪いためにNMRで複合体中の構造変化を検出するまでには至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
非常に疎水性が高く取り扱いが困難なタンパク質であるにもかかわらず、さらに塩基性アミノ酸残基を除いた配列を準備し、MPIaseとの相互作用を検証することができた。SPRの実験結果と計算による知見が一致し、相互作用に重要な因子を明らかにすることができた。コロナの影響で実験に制限がかかったが、データ解析と組み合わせることにより、比較的遅れることなく進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで用いてきた基質タンパク質Pf3 coat proteinについて、Ｃ末端部分の塩基性アミノ酸残基とピロリン酸との相互作用、またMPIaseのアセチル基とタンパク質の疎水性部位が重要であることが明らかになったので、別のタンパク質についても同様の解析を実施する。Ｃ末端部分の塩基性アミノ酸残基は膜タンパク質に共通してみられる構造であるため、一般性を検証する。MPIaseは幅広い膜タンパク質を基質とすると考えられるので、種々の性質をもったタンパク質を選び、CDにより複合体形成を追跡する。溶解性が悪いPf3では観測できなかったNMRでの構造変化解析にも期待している。異なるタンパク質をSPRで比較するためには、糖鎖側を固定する必要があり、ピロリン酸化糖鎖にリンカーを付与した試料を合成する。本類縁体は、生合成酵素探索にも有用であると期待される。
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