2019 Fiscal Year Annual Research Report
全てのリン酸化酵素を標的としたフォールディング中間体阻害の評価系構築
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19H02856
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
喜井 勲 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (80401561)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | リン酸化酵素 / DYRK1A / フォールディング / 阻害剤 / 低分子化合物 / キノーム / 自己リン酸化 / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、このフォールディング中間体特異的阻害の概念を、ヒトゲノムにコードされる全518種類のタンパク質リン酸化酵素へと拡張し、リン酸化酵素フォールディング中間体に対して、化合物がどのような阻害プロファイルを示すかを網羅的に評価する実験系を構築する。
2019年度の研究では、（１）これまでに作製したリン酸化酵素in vitro translation用発現ベクターを用いて、いくつかの化合物による分子内自己リン酸化阻害の活性評価を実施した。その結果、フォールディング中間体阻害剤は必ずしもリン酸化酵素の分子内自己リン酸化を阻害する訳ではないことが判明した。これは、当初の分子内自己リン酸化を指標としてフォールディング中間体特異的阻害剤を同定・解析する計画では、取りこぼしてしまう化合物があることを意味している。そのため、本計画のうち自己リン酸化を指標とする点について修正を行うこととした。同時に進めていたプロジェクトでは、（２）リン酸化酵素の活性ドメインに対するフォールディング阻害剤の作用を直接検出するシステムの構築を行なったが、こちらが成功した。このシステムでは、自己リン酸化ではなく、リン酸化酵素フォールディング中間体の活性ドメインと阻害剤の複合体形成を直接検出して中間体特異的阻害活性を評価するため、上記の問題を解決できている。そこで本研究では、この（２）のシステムを全てのリン酸化酵素に対して適用する基盤技術を開発する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度の研究では、（１）これまでに作製したリン酸化酵素in vitro translation用発現ベクターを用いて、いくつかの化合物による分子内自己リン酸化阻害の活性評価を実施した。その結果、フォールディング中間体阻害剤は必ずしもリン酸化酵素の分子内自己リン酸化を阻害する訳ではないことが判明した。これは、当初の分子内自己リン酸化を指標としてフォールディング中間体特異的阻害剤を同定・解析する計画では、取りこぼしてしまう化合物があることを意味している。当初の計画通りには進んでいないため、「やや遅れている」と判断した。しかし、同時に進めていたプロジェクトでは、（２）リン酸化酵素の活性ドメインに対するフォールディング阻害剤の作用を直接検出するシステムの構築を行なったが、こちらが成功した。このシステムでは、自己リン酸化ではなく、リン酸化酵素フォールディング中間体の活性ドメインと阻害剤の複合体形成を直接検出して中間体特異的阻害活性を評価するため、上記の問題を解決できている。全体としては、自己リン酸化を検出するシステムより汎用性の高いシステムの構築が可能になると期待されるため、研究の進捗としては、当初想定していた内容よりも充実した形になると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の通り、当初想定していた方向性とは異なるが、新しい発展性が見えて来た。ゴールに変更はないため、このルート変更により、汎用性の高いスクリーニング技術の創出が可能になると期待される。このルート変更により得られる技術については、特許出願を行う必要があるため、2020年度は特許出願に必要なデータ取得を中心に研究を推進する。特に、特許範囲の拡大を目的とし、本技術を多くのタンパク質に適用可能なものであることを示す必要があると考えている。そのための予算の獲得なども含めて、研究を推進していく。
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