Molecular mechanisms underlying metabolism and transport of fatty acids and their regulation in arbuscular mycorrhiza

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02861
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 齋藤 勝晴 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (40444244)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 菌根 / 共生 / 脂質

Outline of Annual Research Achievements

アーバスキュラー菌根菌への脂質供給に関与する植物の脂質合成・輸送・制御機構を明らかにするため、各種遺伝子のミヤコグサ変異体を取得・作出し（挿入変異体、RNAi法）、菌根共生における脂質関連遺伝子の機能を解析する。海外の研究では、植物が菌根菌に供給する脂質としてsn-2 モノパルミチン酸グリセリルが有力視されている。しかし、未だ決定的な証拠は得られていない。本研究では、ミヤコグサ変異体に安定同位体を添加し、クロマトグラフィ分析や質量分析により脂質の分子種を同定する。さらに、植物からアーバスキュラー菌根菌に供給される脂質を定量し、植物にとっての共生に対するコストを評価する。本年度は以下の2つの課題を実施し、菌根共生に関与する植物の脂質合成・輸送・制御機構の一部を明らかにした。
１．脂質合成関連遺伝子の機能解析
脂肪酸合成関連遺伝子については、脂肪酸の活性化に関与するアシルCoA合成酵素（LACS）にターゲットを絞り菌根共生における機能を解析した。モデルマメ科植物のミヤコグサには９つのLACS遺伝子があり、菌根で遺伝子発現が高誘導される遺伝子を特定した。ミヤコグサの挿入変異体を用いてアーバスキュラー菌根菌の感染を確認し、２つの変異体系統で樹枝状体形成率が若干低下することが明らかとなった。この遺伝子の効果をさらに明らかにするため、過剰発現系統を作製している。
２．脂質合成制御遺伝子の機能解析：WRI5転写因子は樹枝状体の形成に関与することが報告されている。しかし、WRI5の下流でどのような脂質合成関連遺伝子が発現制御されるかは分かっていない。RNAi発現抑制系統を用いて脂質代謝に関係する遺伝子発現を解析したところ、菌根形成時に誘導される脂質代謝遺伝子の発現がRNAi系統で低下していることから、WRI5遺伝子はこれらの遺伝子発現制御に関与していることが考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね当初の計画の通り研究は進展していおり、現在までに以下の2つの課題を実施し、菌根共生に関与する植物の脂質合成・輸送・制御機構の一部を明らかにした。
１．脂質合成関連遺伝子の機能解析：脂肪酸合成関連遺伝子については、脂肪酸の活性化に関与するアシルCoA合成酵素（LACS）にターゲットを絞り菌根共生における機能を解析した。ミヤコグサには９つのLACS遺伝子があり、菌根で高度に発現誘導される１つの遺伝子を特定した。ミヤコグサの挿入変異体を用いてアーバスキュラー菌根菌の感染を確認し、２つの変異体系統で樹枝状体形成率が若干低下することが明らかとなった。過剰発現の効果を調べるため、LACS遺伝子を導入した系統の作製を継続している。
２．脂質合成制御遺伝子の機能解析：WRI5転写因子は樹枝状体の形成に関与することや、RAM1転写因子と相互作用し一部の遺伝子が発現誘導されることが報告されている。しかし、WRI5の下流でどのような脂質合成関連遺伝子が発現制御されるかは分かっていない。そこで、RNAi発現抑制系統を用いて脂質代謝に関係する遺伝子発現を解析した。菌根形成時に誘導される脂質代謝遺伝子の発現がRNAi系統で低下していることから、WRI5遺伝子はこれらの遺伝子制御に関与している可能性が考えられた。

Strategy for Future Research Activity

１年目はおおむね順調に進んでいるため、２年目は当初の計画通り、以下の４つの課題を実施し、菌根共生に関与する植物の脂質合成・輸送・制御機構を明らかにする。
１．脂質合成関連遺伝子の機能解析：脂肪酸合成関連遺伝子については、脂肪酸の活性化に関与するアシルCoA合成酵素（LACS）について菌根共生における機能を解析する。ミヤコグサの挿入変異体と過剰発現個体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡などを用いて詳細に形態を観察するとともに、組み換えLACSタンパク質を用いて脂肪酸に対する特異性を明らかにすることで植物が産生する脂肪酸の分子種を推定する。
２．脂質輸送遺伝子の機能解析：脂質輸送に関しては、菌根誘導性の脂質輸送タンパク質（LTP）とGDSLリパーゼに着目して、RNAi法で発現抑制系統を作出し、菌根共生の表現型を解析する。LTPは分泌タンパク質として予想され、菌根菌へ脂質を直接輸送している可能性がある。そこでLTPについては、その局在を免疫電顕で解析し、脂質の輸送過程を追跡する。
３．脂質合成制御遺伝子の機能解析：菌根特異的脂質合成の制御に関わると考えられるWRI5転写因子について、前年度に引き続きRNA-seqの解析を行う。
４．脂質同定：脂質合成変異体（DIS, FatM, RAM2, STR）の解析から、植物から供給される脂質はsn-2 モノパルミチン酸グリセリルと考えられているが、今のところ直接的な証明はない。本課題では、上記の課題で作出する輸送系遺伝子（LTP, GDSLリパーゼ）の変異体を利用して、脂質を分析し輸送される脂質を推定する。脂質/脂肪酸の分析には、LC-MS/MSやガスクロマトグラフィーを利用する。今年度は、またレーザーマイクロダイセクションで切り出した感染細胞についても脂質/脂肪酸分析を行うため、切り出しの条件検討や分析法を検討する。