大腸菌の呼吸鎖欠損株が示す異常な糖代謝の機構解明と発酵生産ロバスト化への応用

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02863
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 横田 篤 北海道大学, 農学研究院, 教授 (50220554)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 和田 大 摂南大学, 農学部, 教授 (00301416) ; 片岡 尚也 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (50713509)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 大腸菌 / 呼吸鎖 / グルタミン酸 / γーアミノ酪酸

Outline of Annual Research Achievements

I. 大腸菌の呼吸鎖欠損ΔΔ株の異常な糖代謝の機構解明 (北大:横田/和田)：ΔΔ株(NDH-IとCytbo3を共に欠損)は、グルタミン酸(Glu)を著量蓄積し、Gluをγ-アミノ酪酸(GABA)に変換するグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子gadAB、GABAをコハク酸セミアルデヒドに変換する2-オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(gabT)、コハク酸セミアルデヒドをコハク酸に変換するコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子(gabD)を高発現していた。そこで、ΔΔ株からこれらの遺伝子を欠損させた株を構築した。しかしながら、いずれの遺伝子を欠損させてもGlu生産量に差は見られず、酵素活性においても、転写量と同程度まで活性は上昇しておらず、Gadについては活性が検出されなかった。これらの結果から、Gluの著量蓄積はこれら酵素によるものではないことが示唆された。
II. GABA生産株の育種 (北大:和田/横田):中性で活性を示す変異型GadB*遺伝子をΔΔ株の染色体上に導入することで、GABA生産株の構築を試みたが、目的の株は得られなかった。
III. ΔΔ株を宿主とした1,3-ブタンジオール(1,3-BD)生産の効率化 (山口大:片岡/北大: 横田)：まずW1485派生株での生産比較実験を検証するべく、LacIタンパク質を予めプラスミドで供給する方法での1,3-BD生産系の付与を試みた。しかし、安定した形質転換株の取得には至らなかった。そこで、昨年度と同様にMG1655派生株を用いて培養条件を精査した。その結果、野生株とΔΔ株で1,3-BD生産において最大の力を発揮するためのIPTG濃度が異なることが明らかになり、各株を最適IPTG濃度でジャーファーメンターを用いて回分培養したところ、ΔΔ株は野生株と比較して約1.7倍高い1,3-BD生産性を示すことが分かった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

I. 大腸菌の呼吸鎖欠損ΔΔ株の異常な糖代謝の機構解明 (北大:横田/和田)：ΔΔ株の異常な糖代謝機構、特にGluの著量蓄積について、今年度は数多くの候補遺伝子の貢献について解析したが、候補の中からGluの著量蓄積に著しい影響を及ぼす酵素を同定するには至らなかった。しかしながら、Gluの生合成に関与する酵素は限られており、未検証な酵素は概ねGluを生成する直接の酵素反応にまで絞ることができたため、異常な糖代謝機構の解明に近づくことができたと考えている。
II. GABA生産株の育種 (北大:和田/横田)：変異型GadB*遺伝子をΔΔ株の染色体上に導入はできなかった。一方、GadB*遺伝子をローコピープラスミドに載せ、これを野生株に導入し、酸性と中性条件下におけるGadの酵素活性を測定したところ、GadB*のみ中性条件で活性を示すことを確認した。
III. ΔΔ株を宿主とした1,3-ブタンジオール(1,3-BD)生産の効率化 (山口大:片岡/北大: 横田)：研究実績の概要の欄に記載したとおり、培養条件を精査したところ、MG1655派生株を用いることで、目的としていたΔΔ株の1,3-BD生産における有効性をある程度顕著に示すことができたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

I. 大腸菌の呼吸鎖欠損ΔΔ株の異常な糖代謝の機構解明 (北大:横田/和田)：大腸菌において一般的にGluを生成していることが明らかなGlu脱水素酵素（GDH）とGlu合成酵素（GOGAT）に着目し、これらをコードしている遺伝子をΔΔ株から削除することで、ΔΔ株におけるGluの著量蓄積機構の解明を目指す。
II. GABA生産株の育種 (北大:前田/横田)：変異型GadB*遺伝子をローコピープラスミドに載せ、これをΔΔ株に導入し、GABAの生産量を野生株と比較する。
III. ΔΔ株を宿主とした1,3-ブタンジオール(1,3-BD)生産の効率化 (山口大:片岡/北大: 横田)：今後は、(1) ΔΔ株における更なる1,3-BD生産性の向上を目指した細胞内酸化還元レベルの改変が1,3-BD生産に与える影響の解析、(2) 最適培養条件での流加培養による1,3-BD収量の向上、 (3) ΔΔ株の物質生産宿主としての汎用性の証明、に取り組む。これらのアプローチにより、設定していた1,3-BDだけでなく、他の化合物生産においてもΔΔ株が有効性を持つことを示していきたい。