2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of hierarchical functional control of plant ion transporters driven by intracellular regulatory factors
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19H02880
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
魚住 信之 東北大学, 工学研究科, 教授 (40223515)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石丸 泰寛 東北大学, 工学研究科, 准教授 (80590207)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | イオン輸送体 / 脂質修飾 / 浸透圧 / 恒常性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は，様々な環境の変化に適応することが必要であり，乾燥・脱水・塩害などに応じた恒常性維持をする仕組みを備えている．植物イオン輸送体はその応答機構分子として機能しており，養分吸収，浸透圧調節，膜電位形成，細胞内酵素の活性化と不活化を行うことにより，直接および間接的に関与して恒常性の維持，増殖と分化において重要な役割を担っている．本研究では，これまで申請者が行ってきたイオン輸送体に関する結果に基づいて，未解明となっているイオン輸送体の機能と役割とその統御の機構の解明をはかることを目的としている．本年度は，パルミトイル化修飾酵素の検討を行い，パルミトイル化修飾酵素を受けるシロイヌナズナのリン酸化酵素の複合体の機能と膜への移行に関する検討を行った．植物細胞を用いた検討はパルミトイル化修飾酵素のバックグランドが高いため，検出が難しいことから，酵母のパルミトイル化修飾酵素遺伝子変異株を用いた発現系を利用して脂質修飾の影響を調べた．検出実験は，シロイヌナズナのパルミトイル化修飾酵素の自己修飾活性で脂質修飾を検出した．この際，脂質修飾が起こらないものが1つ存在したことから，今後は測定条件を変更して就職検出を行う必要がある．また，脂質修飾されている残基とされない残基の検出する順序の変更を行って比較することが必要であることも明らかになった．このように今回の測定では酵母発現系の有効性を評価しながら，測定条件の予備検討および実験条件の最適化をすすめることができたことから，次年度においても測定を続けることが可能である．さらに，２年度以降に検討することとなる植物内におけるイオン循環を調べる系の構築と植物イオン輸送の検討を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脂質修飾を受けることによって，目的の生体膜に移行して機能するCBL-CIPK複合体が酵母発現系で機能することが分かり，本解析系は有効に利用できることが明らかとなった．酵母のパルミトイル化修飾酵素変異遺伝子が欠損酵母において，そのバックグラウンドとして低い活性を持つことが確認された．今回，植物のパルミトイル化修飾酵素遺伝子をこの変異酵母に導入して脂質修飾を行ったところ，ほとんどの遺伝子産物において脂質修飾施が検出された．今回は自己パルミトイル化修飾であり，この脂質修飾の頻度は生体膜への局在化効率やリン酸化酵素の活性にも影響を与えることが考えられる．シロイヌナズナには複数のパルミトイル化修飾酵素が存在することは脂質修飾によっても強弱があり，また脂質修飾を受ける酵素の活性の度合いにも影響すると予想された．細胞内で階層的に制御されるイオン輸送体を考えると，この脂質修飾酵素の多様性は詳細な反応調節に必要であると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の結果から，脂質修飾酵素の機能活性測定が酵母発現系を利用して解析できることが分かったことから，2年目以降に向けて解析を続ける．解析する機能未知のパルミトイル基転移酵素遺伝子を既にほぼ全部をプラスミドに載せていることから，酵母変異株に導入して，脂肪酸修飾が生じるか否かの検討を行う．一方，今年度の測定の中で，酵母におけるタンパク質発現が検出できないクローンがあった．目的タンパク質のC末端にタグをつけていることから，N末端に付けた蛋白質を試みる．免疫沈降に条件についても検討が必要でありより高感度のタンパク質の検出をめざす．また，脂質修飾が起こっているCysと生じていないCysを区別するための操作を連続して行っているが，その順序を逆にした場合と比較して，検出度合いを最適化する．還元剤の混入によって脂質修飾の感度に大きな影響がみられることから，還元剤をできる限り取り除いた条件に関する検討を行う．繰り返し実験を行い，再現性の高い結果を取得するように務める．シロイヌナズナのパルミトイル基転移酵素遺伝子変異株を種子ストック組織から取り寄せて，ホモ化をすすめて，２年度以降に検討するための準備を行う．
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