2020 Fiscal Year Annual Research Report
植物「嗅覚（揮発性化合物を認識し生体シグナルへと変換する過程）」の解明
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19H02887
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
松井 健二 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (90199729)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高林 純示 京都大学, 生態学研究センター, 教授 (10197197)
渡辺 文太 京都大学, 化学研究所, 助教 (10544637)
岡田 憲典 東京大学, 生物生産工学研究センター, 准教授 (20312241)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 植物嗅覚 / カルシウムシグナル / プロテアーゼインヒビター / みどりの香り |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では植物の「嗅覚」の分子機構解明を目指している。2020年度はカルシウムセンサータンパク質GCaMP発現シロイヌナズナを用いた嗅覚モニタリング実験でシロイヌナズナは高濃度の(Z)-3-ヘキセナールには応答するが、実際の植物から放散される濃度の香り化合物には応答しないことが明らかとなった。ただ、植物体内で発生するのと同程度の濃度の香り化合物溶液で処理することで応答が見られ、カルシウム流入を介した応答は植物間コミュニケーションには寄与しないが植物体内の組織間コミュニケーションに寄与している可能性が示唆された。この知見をもとに組織間コミュニケーションに寄与する化学感覚システムの解明研究をスタートさせた。
一方、トウモロコシで(Z)-3-ヘキセニルアセテートガスによってプロテアーゼインヒビター遺伝子の誘導が惹起されることを確認した。そこで、種々の構造類縁体を用いて構造活性相関解析を進め、トウモロコシの応答には3位のZ二重結合が重要であることが明らかとなった。そのうえで研究分担者の渡辺によりケミカルプローブデザインのための合成類縁体が調製され、それらを用いることで(Z3)構造だけでなく、エステル結合も重要な因子であることが明らかになってきた。一般にエステル化合物が細胞内に取り込まれると速やかにエステラーゼにより加水分解される。そのため、(Z)-3-ヘキセニルアセテートによる遺伝子誘導の究極物質が(Z)-3-ヘキセノールであることが示唆された。この結果を元にケミカルプローブのリデザインを進め、同時に遺伝子誘導へのエステラーゼの重要性の確認と(Z)-3-ヘキセノールを母核構造とした類縁体によるアッセイを進めることとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GCaMPを用いた検討で当初問題となった導入遺伝子のサイレンシングはGCaMP発現用のプロモーターを植物由来のユビキチンプロモーターに変更することで克服できた。その後、(Z)-3-ヘキセナールガスを用いたアッセイでカルシウム流入が再現性良く確認されたが、濃度依存性を解析すると、実際の生態系で検出される(Z)-3-ヘキセナール濃度では応答が認められないことが判明した。このことは当初予期していなかったが、より精細に解析を進め、実際に植物が生産する濃度の溶液を用いると応答することを発見し、その仕組みの解明へとシフトすることとした。植物の化学感覚において気体状のシグナル物質と溶液状のシグナル物質が見分けられている可能性が示唆され、植物化学感覚の新たな概念創出につながることが期待される。
一方、トウモロコシを用いた検討では研究分担者の渡辺により合成された化合物も含めた(Z)-3-ヘキセニルアセテート構造類縁体を用いた構造活性相関が順調に進み、嗅覚に支配される遺伝子誘導にZ3-アルケン構造とエステル結合が重要であることが明らかとなった。その成果に基づいて究極物質が(Z)-3-ヘキセノールである可能性が示唆されてきた。こうした構造活性相関解析の成果に基づいてトウモロコシの嗅覚を担う受容体の単離に向けたケミカルプローブのデザインが更に進むこととなった。更に、新しいプロジェクトとして京都大学の本庄准教授との共同研究を立ち上げ、(Z)-3-ヘキセニルアセテート処理したトウモロコシのトランスクリプトーム解析を開始した。既にライブラリーは作成し、シーケンシングを外注して結果を待っているところで、トウモロコシ嗅覚が支配する遺伝子発現制御ネットワークの全貌が明らかになると期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
GCaMPを用いた植物嗅覚のモニターについては液体培地で生育させたモニター植物に化合物を溶液状態で添加する実験系の最適化を進める。そのうえで、構造活性相関、濃度依存性を検討する。また現在は植物一個体を蛍光実体顕微鏡で観察しているが、冷却CCDカメラを装備したマクロイメージングシステムを用いた観察システムを確立して化学変異体プールのスクリーニングを進める。
トウモロコシをモニター植物とした実験系では細胞内でのエステラーゼによる加水分解の寄与を見積もる必要がある。渡辺が合成した類縁体で非天然の酸部分をもつ(Z)-3-ヘキセノールエステルがあり、加水分解によってその酸部分が切り出される。これをGC-MS検出し、エステラーゼ反応の程度を見積もる。また、(Z)-3-ヘキセノールをリード化合物とした類縁体のデザインを進め、遺伝子誘導の鍵構造を明らかにする。そのうえでケミカルプローブのデザイン、合成、受容体との反応をフォトアフィニティーカップリング、クリックケミストリにより固定し、受容体をプルダウンする。なお、こうして得られた受容体候補の機能を確定するには当該遺伝子のノックダウンが必須となる。トウモロコシの遺伝子操作は容易でなく時間もかかるのでミナトカモジグサの使用を想定している。その準備としてミナトカモジグサで同じ応答が見られるのか随時確認する。
さらに2021年度初めに得られるトランスクリプトームデータを整理解析し、植物嗅覚で支配される遺伝子群のリストアップを進め、転写因子を含め信号伝達経路に関わる遺伝子についての解析を進める。
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