2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H02890
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
伊藤 昭博 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (40391859)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堂前 直 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, ユニットリーダー (00321787)
どど 孝介 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (20415243)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リジンアシル化 / TEAD / Hippo経路 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リジン残基上で起こる長鎖脂質修飾の機能を明らかにすることを目的に、令和元年度は以下の3点について研究を推進した。
1. リジン長鎖脂質修飾によるTEADの活性制御。生細胞内でリジン長鎖脂質修飾がTEADの転写共役因子YAPとの相互作用に影響を与える調べる目的で、分割ルシフェラーゼ法の一つであるNanoBiTテクノロジーを用いて、生細胞内でTEADとYAPの結合活性を検出可能なアッセ系を構築した。本アッセイ系を用い、アシル化出来ないKR変異体は、YAPとの結合活性が有意に低下することを示し、生細胞内においてTEADのリジン長鎖脂質修飾はYAPとの結合に重要であることを明らかにした。
2. TEADのリジン脱長鎖アシル化酵素の同定。TEAD由来のリジンミリストイル化ペプチドを基質とし、in vitroで脱ミリストイル化酵素活性を有する既存のリジン脱アセチル化酵素（KDAC）を検討したところ、複数のサーチュインが活性を有していることを明らかにした。
3. リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な探索法の確立。リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な探索法として、１）Pan-リジンミリストイル化抗体を用いたアフィニティー精製法、２）金属ビーズを用いたアルキンペプチド濃縮技術を応用した方法、３）クリック反応による方法について検討した。Pan-リジンミリストイル化抗体を用いた方法については、本抗体はリジンミリストイル化修飾依存的にリジンミリストイル化ペプチドの免疫沈降可能であることが明らかにし、本法を用いた網羅的な探索が可能であることを示唆する結果を得た。金属ビーズを用いた方法については末端にアルキンが付加されたモデルペプチドを用いて、クリック反応を用いた方法についてはビオチンの代わりにFlagペプチドを付加したアジドプローブを用いて、それぞれ濃縮条件等について検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、リジン残基上で起こる長鎖脂質修飾の機能を明らかにすることを目的としている。本年度は、先行研究により同定したTEADのリジン長鎖脂質修飾の機能とその制御機構の解明および、リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な探索法の確立を目的に研究を行なった。
生細胞内でTEADとその転写共役因子YAPとの相互作用を検出可能なNanoBiT法によるアッセイ系を確立し、生細胞内でTEADのリジン長鎖脂質修飾はYAPとの結合に重要であることを示すことが出来た。また、リジンミリストイル化ペプチドを基質としたin vitroの酵素アッセイ系を構築し、TEADに対する脱アシル化酵素活性を有する既存のリジン脱アセチル化酵素の同定に成功した。以上の結果から、TEADのリジン長鎖脂質修飾の機能とその制御機構の一端を明らかにすることが出来たと考える。一方、リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な探索法の確立については、作製したPan-リジンミリストイル化抗体が、リジンミリストイル化修飾依存的にペプチドの免疫沈降可能であることが分かり、本法を用いてリジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な探索が可能であることを示すことができた。加えて、末端にアルキンが付加されたモデルペプチドを用いて、金属ビーズによる溶媒等の濃縮条件を決定した。また、ビオチンの代わりにFlagペプチドを付加したアジドプローブを用いて脂肪酸アルキンを処理した細胞の抽出液からクリック反応の条件を検討し、Flagペプチドを付加したアジドプローブによる濃縮が可能であることを示唆する結果を得た。以上の結果から、当初予定していた目標については概ね達成することが出来たと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
リジン残基上で起こる長鎖脂質修飾の機能を明らかにすることを目的に、リジン長鎖脂質修飾によるTEADの活性制御機構の解明と、リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な同定を目指し、引き続き以下の研究を推進する。
1. リジン長鎖脂質修飾によるTEADの活性制御。TEADの長鎖脂質修飾は、生細胞内でYAPとの結合に重要であることが分かった。そこで、in vitro TEAD-YAP相互作用検出系を構築し、長鎖脂質修飾がin vitroでもYAPとの結合に重要であるかどうか明らかにする。加えて、YAP結合依存的なTEADの転写活性を検出可能なレポーターアッセイ系を構築し、長鎖脂質修飾がTEADの転写活性に与える影響を検討することにより、TEADの活性制御におけるリジン長鎖脂質修飾の重要性を明らかにする。
2. TEADのリジン長鎖脂質修飾制御機構の解明。In vitroで脱アシル化酵素活性を有することが分かったリジン脱アセチル化酵素（KDAC）について、過剰発現あるいはノックダウン実験により、細胞内でTEADを脱アシル化酵素として機能するKDACを同定し、TEADのリジン長鎖脂質修飾制御機構の解明につなげる。
3. リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な同定。Pan-リジンミリストイル化抗体を用いたアフィニティー精製法、金属ビーズを用いたアルキンペプチド濃縮技術を応用した方法、Flagペプチド融合アジドプローブを用いたクリック反応を利用した方法について、モデルペプチド等を用いて引き続き最適な条件を検討する。条件が決まった方法を用いて、リジン長鎖脂質修飾タンパク質の網羅的な同定を目指す。
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Research Products
(6 results)
