2019 Fiscal Year Annual Research Report
非古典的ストリゴラクトン生合成に関与するシトクロムP450酵素ファミリーの解析
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19H02892
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
増口 潔 京都大学, 化学研究所, 助教 (00569725)
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2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物ホルモン / 生合成 / ストリゴラクトン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ストリゴラクトンは、根圏では根寄生植物やアーバスキュラー菌根菌に作用するアレロケミカル、植物体内では枝分かれなどを制御する植物ホルモンとして多面的に機能する生理活性分子である。本研究では、予備研究の中で見出した新規シトクロムP450酸化酵素を足がかりにして、非古典的ストリゴラクトンの生合成と代謝に新しい知見を与えることを目的とする。
平成31年度は、以下の実験結果を得た。
(1) 当該遺伝子のリコンビナントタンパク質を調製し、ストリゴラクトン関連化合物に対する酵素活性を検証したところ、本酵素タンパク質はストリゴラクトン生合成中間体であるカーラクトンや活性型ストリゴラクトンの1つと考えられているカーラクトン酸メチルを、それぞれ複数の代謝産物へと変換することが明らかとなった。一方、カーラクトン酸に対する反応性は低いことが明らかとなった。
(2) (1)の代謝産物の1つは、LC-MS/MS分析において野生型イネの水耕液から検出され、ストリゴラクトン欠損変異体d17の水耕液では検出限界以下であったため、イネ内生のストリゴラクトンである可能性が高いと考えられた。
(3) イネを用いて当該酵素遺伝子の過剰発現株と破壊株の作出を行った。また、シロイヌナズナにおける当該酵素遺伝子の過剰発現体の作製を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該酵素は、カーラクトンとカーラクトン酸メチルを代謝し、それらの代謝産物の１つはイネの新しい分泌型ストリゴラクトンであることが示唆された。しかし、これらの代謝産物の化学構造は未知であり、今後、カーラクトンやカーラクトン酸メチルの類縁体標品を用いた比較分析などにより、化学構造の追究を行う必要がある。また、イネおよびシロイヌナズナを用いて作製した当該遺伝子の過剰発現株や破壊株のホモラインを整備し、それらの表現型解析などを行うことで、当該酵素の生理機能を明らかにする必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
H31年度の結果を基に、下記の実験を実施する。
(1) 当該酵素の酵素反応試験において確認された代謝産物の化学構造を明らかにするため、カーラクトンやカーラクトン酸メチルの類縁体標品を用いた比較分析を行う。また、他の植物における当該酵素のホモログについても同様に酵素タンパク質を調製し、ストリゴラクトン生合成中間体を基質にした酵素反応試験を行う。
(2) H31年度に引き続き、植物の水耕液や抽出液を精製し、実験(1)の酵素反応産物が、実際に植物の内生に存在するか否かについて、液体クロマトグラフ質量分析計を用いた定性分析により明らかにする。
(3) イネおよびシロイヌナズナを用いて作製した当該遺伝子の過剰発現株や破壊株のホモラインを整備し、これらの形質転換植物体ホモラインにおける実験(1)の酵素反応産物の内生量を調査することで、試験管内における酵素反応産物が植物体内においても当該酵素の代謝産物であることを実証する。また、形質転換植物体の表現型解析などにより、当該酵素の代謝産物の生理機能を推察する。
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