2020 Fiscal Year Annual Research Report
非古典的ストリゴラクトン生合成に関与するシトクロムP450酵素ファミリーの解析
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19H02892
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
増口 潔 京都大学, 化学研究所, 助教 (00569725)
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2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物ホルモン / ストリゴラクトン / 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ストリゴラクトンは、根圏では根寄生植物やアーバスキュラー菌根菌に作用するアレロケミカルとして、植物体内では枝分かれなどを制御する植物ホルモンとして多面的に機能するカロテノイド由来の生理活性分子である。ストリゴラクトンの化学構造は多様性に富んでおり、最初にワタの根滲出物から発見されたストリゴールをはじめとして、これまで様々な植物から四環性骨格を有するストリゴラクトンが同定されてきた。一方、最近になってD環部分は保存されているものの、古典的なストリゴラクトンの化学構造とは異なる新しいタイプのストリゴラクトンがいくつかの植物種から報告されている。本研究では、予備研究の中でイネより見出した新規シトクロムP450酸化酵素（OsCYP）を足がかりにして、非古典的ストリゴラクトンの生合成と代謝に新しい知見を与えることを目的とする。
令和2年度は、以下の実験結果を得た。
(1) 昨年度までにOsCYPのリコンビナントタンパク質は、ストリゴラクトン生合成中間体であるカーラクトンとカーラクトン酸メチルを基質にすることを示した。本年度は、カーラクトン酸メチルを基質にした場合の酵素反応産物の1つが、共同研究により入手したイネの水耕液から同定された新規ストリゴラクトンの合成標品とLC-MS/MSにおける保持時間とフラグメントイオンパターンが一致することを明らかにした。
(2) CRISPR-Cas9システムを利用し、イネにおけるOsCYPの遺伝子破壊株2ラインを確立した。現在までに両ラインの水耕液と根抽出物から、上記新規ストリゴラクトンは検出されておらず、植物体内でもOsCYPが新規ストリゴラクトンの生合成に重要な機能を有することが示唆された。また、OsCYPのシロイヌナズナにおける過剰発現ラインを確立した。
(3) シロイヌナズナを用いてOsCYPホモログの過剰発現ラインの整備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、OsCYPのカーラクトン酸メチルを基質にした場合の酵素反応産物の1つが、共同研究により入手したイネの新規ストリゴラクトンの合成標品と一致することが判明し、研究が大きく前進した。また、OsCYPの酵素反応中間体として、上記合成標品の類縁化合物が想定されたが、実際にOsCYPの酵素反応液中にこの化合物が存在することもLC-MS/MS分析により明らかとなった。この酵素反応中間体も、イネの内生もしくは水耕液に存在するストリゴラクトンであるかについては今後検証を進める予定である。また、OsCYP破壊株を用いた分析により、植物体内でもOsCYPが新規ストリゴラクトンの生合成に重要な機能を有することが示された。今後、OsCYP破壊株の表現型解析などを行うことで、OsCYPや新規ストリゴラクトンの生理機能について考察を行う必要がある。また、イネにおけるOsCYP過剰発現体の作出を急いで進める必要があるが、本年度に確立したシロイヌナズナにおけるOsCYP過剰発現ラインの解析も同時に進めることで、OsCYPや新規ストリゴラクトンの生理機能を追究していく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度までの結果を基に、下記の実験を実施する。
（1）上述の新規ストリゴラクトンやその酵素反応中間体を、イネの野生型、ストリゴラクトン生合成変異体、ストリゴラクトン信号伝達変異体、OsCYP破壊株を材料にして引き続き分析を行い、論文発表の準備を進める。また、遅れているイネのOsCYP過剰発現体の作出を進めるとともに、イネのOsCYP破壊株やシロイヌナズナのOsCYP過剰発現ラインの表現型解析を行う。さらに、OsCYPの発現部位やリン欠乏応答性などについて遺伝子発現解析により調査する。
（2）イネ近縁植物種におけるストリゴラクトン分析を行い、イネより見出した新規ストリゴラクトンがどの程度の植物種に分布しているのか検証する。同時に、それらの植物種におけるOsCYPホモログの酵素反応試験を行い、それらの酵素活性と新規ストリゴラクトンの有無に関連性があるのか検討する。
（3）引き続き、シロイヌナズナを用いて他の植物種におけるOsCYPホモログの過剰発現ラインの整備を進めるとともに、ホモラインが得られたラインから順次、ストリゴラクトンに関連する枝分かれなどの表現型を調査する。表現型が認められたOsCYPホモログについては、リコンビナントタンパク質を調製し、試験管内での酵素反応試験を実施する。
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