生合成酵素エンジニアリングと合成生物化学的アプローチによるテルペン精密酵素合成

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02894
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 川出 洋 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20291916)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊増 知伸 山形大学, 農学部, 教授 (60272085)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: diterpene cyclase / ent-kaurenene / ent-kaurenoic acid

Outline of Annual Research Achievements

当該年度の研究実施計画は次の通りで，それに対する実績・成果を記す．
【研究代表者】［１．新ジテルペン創製酵素の作出］：本提案については微生物・植物由来のジテルペン環化酵素をテンプレートにHOMOCOS等のモデリングソフト・タンパク質可視化ソフトを用いながら合理的な変異箇所の選択と変異実験を行った．タキサジエン合成酵素をもちいて，活性中心の変異とともにループ構造を司る箇所の変異を行うことによって，酵素生成物を変化させることが出来たとともに活性を高めることにも成功した．構造未知の化合物を取得したのでその構造を解析した結果，センブレンＡに変わったことを確認した．また，ent-カウレン酸酸化酵素（GA12合成酵素）をテンプレートに3(OH)-カウレン酸の創出を試みた．7(OH)-カウレン酸や16(OH)-カウレン酸を生成する変異酵素を作出した．3(OH)-カウレン酸と類似するピークも検出されたが，非常に微量であるため同定には至らなかった．一方，P450酵素の活性測定・機能改変技術を使って，コケ由来のP450酵素機能の解明に貢献することが出来，論文発表を行った．［２．酵素―テルペン化合物のデュアル生産システム］：本提案については，当初予定していた中鎖直鎖状テルペンの創出が変異実験により目的酵素が得られなかった．酵母菌の分子育種についても引き続き遺伝子導入株からスクリーニングを続けることにする．
【研究分担者】［３．新規ジテルペン生合成環化酵素の探索］：本提案ではin silicoスクリーニングから得られたCPS様環化酵素遺伝子１つ，KS様環化酵素遺伝子２つの配列から完全長cDNAをそれぞれ取得し大腸菌での組換え酵素生産を行った．葉抽出物からはジテルペン炭化水素のピークを確認し，キラルカラムや標品等でその立体を今後確認する．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2020年４月から緊急事態宣言の発出や教員・学生の研究室への通勤・通学自粛などにより研究時間の確保が当初は難しかった．年度後半に入り，宣言解除後に誠意努力を続けたが，前半の遅れを十分取り戻すところまでは至らなかった．この反省を次年度に生かしたい．

Strategy for Future Research Activity

最終年度となり，引き続き緊急事態宣言下での研究となることから，大きな研究計画の変更はないが，成果を出すために焦点を絞って研究を実施する．
［１．新ジテルペン創製酵素の作出］に関しては，環化酵素の機能改変を一次凍結し，P450の機能改変実験に集中する．テンプレート酵素は既に別なものを準備し，HOMOCOS等のモデリングソフト・タンパク質可視化ソフトを用いながら活性中心の変異とともにループ構造を司る箇所の変異を行うことによって，酵素生成物を変化させる．
［２．酵素―テルペン化合物のデュアル生産システム］：外来遺伝子の強制発現と生成物蓄積による酵母菌成長の影響を考慮するための方策を考慮したテルペン合成酵母菌の作出を検討する．
［３．新規ジテルペン生合成環化酵素の探索］：今後は，こちらの研究に重点を絞って実施する．立体制御を伴う環化酵素機能の酵素構造と活性の相関をキメラ酵素作出等を行いながら明らかにしていく．

Research Products

• [Journal Article] Genomic evidence for convergent evolution of gene clusters for momilactone biosynthesis in land plants (2020)
  • Author(s): Lingfeng Mao, Hiroshi Kawaide, Toshiya Higuchi, Meihong Chen, Koji Miyamoto, Yoshiki Hirata, Honoka Kimura, Sho Miyazaki, Miyu Teruya, Kaoru Fujiwara, Keisuke Tomita, Hisakazu Yamane, Ken-ichiro Hayashi, Hideaki Nojiri, Lei Jia, Jie Qiu, Chuyu Ye, Michael P. Timko, Longjiang Fan and Kazunori Okada
  • Journal Title: Proceeding of the National Academy of Science in the United States of America Volume: 117 Pages: 12472-12480
  • DOI: 10.1073/pnas.1914373117
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research