生合成酵素エンジニアリングと合成生物化学的アプローチによるテルペン精密酵素合成

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02894
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 川出 洋 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20291916)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊増 知伸 山形大学, 農学部, 教授 (60272085)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: diterpene / ent-kaurene / ent-copalyl diphosphate / conifer

Outline of Annual Research Achievements

１）酵母菌にメバロン酸経路の律速段階であるHMG-CoA還元酵素反応（HMG-CoA reductase反応＝HMGR）の増強と生成物の菌体外排出を促すABCトランスポーターを共発現するコンストラクトを作成し，遺伝子組換え酵母を作成した。菌体外に分泌されるメバロン酸量をGC-MSにて分析したところ，遺伝子導入していない野生型酵母とHMGR増強株では，後者のメバロン酸排出量がわずかに抑制される傾向が見られた（0.94倍）。それに対して，トランスポーターをHMGRと共発現させた株では，メバロン酸分泌量が大幅に増加した（野生株の4.65倍）。一方，メバロン酸経路の増強を細胞質以外のオルガネラで発現させてテルペン量の増大を試みる実験において，β-springene合成酵素遺伝子を細胞質外で発現させると，β-springene生産量が上昇する結果を示した。
２）研究分担者と共同でジテルペン環化酵素の遺伝子取得と組換え酵素生産，酵素機能解析に取組んだ。前年度までに完全長配列が得られたKSL1について大腸菌を用いた実験から，ent-コパリル２リン酸を基質にent-カウレンを生成する酵素（ent-KS）の機能同定を明らかにした。KSL2に関しては酵素活性が得られず，配列を確認したところ完全長ではないことが判明した。新たに３つめのKSL（KSL3）の完全長を次世代シーケンサのデータ解析から見出し，その翻訳領域のPCR増幅実験と大腸菌による組換えタンパク質生産実験を行った。ent-コパリル2リン酸を基質としたジテルペン環化酵素ではないことがわかった。CPSについては，pColdベクターでは組換え酵素生産がうまく行かず，他の宿主―ベクター系での実験を進めている。
なお，P450酵素についての実験は新型コロナウイルスまん延防止等の社会状況を踏まえ，実験を進めなかった。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。