ピースミールオートファジーを介したフレキシブルな葉緑体機能衰退のメカニズム

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02919
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 石田 宏幸 東北大学, 農学研究科, 准教授 (60312625)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: オートファジー / 葉緑体 / Rubisco / 栄養リサイクル

Outline of Annual Research Achievements

葉緑体には窒素栄養の多くが分配されタンパク質として機能している。Rubiscoなどの主要な葉緑体タンパク質は葉の老化時や栄養飢餓条件下では分解され、転流窒素源や糖の代替呼吸基質として個体の成長や生存に重要なリソースとなる。オートファジーは様々な発生過程や飢餓などのストレス条件下で働く真核生物に普遍の細胞内分解システムである。葉緑体は特異小胞RCB（Rubisco-containing body）としてピースミールオートファジーにより分解されるが、その詳細なメカニズムは不明である。本研究では、（1）オートファジー隔離膜による葉緑体の選択的な認識機構について、先行研究によって絞り込んだ葉緑体包膜タンパク質が、オートファジーレセプターとして機能するのかについての検証を行う。さらに（2）各ATG8アイソフォームがRCBに果たす役割について明らかにする。
（1） レセプター候補遺伝子の欠損変異がRCB形成に及ぼす影響について
先行研究で同定した葉緑体外包膜に局在する3種類のレセプター候補をコードする遺伝子を欠損する変異体を取り寄せ、RCBのin vivo観察が可能なgfs9-5変異体との2重変異体を作出した。これらの2重変異体について、RCB蓄積の有無について共焦点レーザー顕微鏡で解析した。その結果、2重変異体では、いずれもgfs9-5の単変異体を同様のRCBのサイトゾルへの蓄積が確認され、これら3種の包膜局在の因子は、RCB形成には必須でなないことが示唆された。
（2）RCB経路におけるATG8アイソフォームの役割の解析
CRISPR/Cas9に基づくゲノム編集法により各ATG8遺伝子をノックアウトさせた個体の作出を進めた。ゲノムシーケンスによりATG8遺伝子上に設計されたガイドRNA配列上流に欠失が確認された個体を選抜した。遺伝子型を確定させるため、遺伝分離によってCas9遺伝子の抜け落ちた個体を選抜後、ノックアウトによってATG8タンパク質が減少していることをウェスタンブロットにより確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

先行研究で同定したレセプター候補の遺伝子が欠損しても、RCB経路は野生型と同様に働くことが示唆された。gfs9-5変異体を活用したRCB経路のin vivoでの評価系は確立しているため、この系を多角的な解析に利用していき、現在の作業仮説となっているモデルを再検証していく必要がある。

Strategy for Future Research Activity

今後、より寄与度の高いレセプター候補を同定していくため、タグ付加したATG8を用いた共免疫沈降法についても積極的に推進していく必要がある。

Research Products

• [Journal Article] Autophagy contributes to quality control of leaf mitochondria (2021)
  • Author(s): Nakamura, S., Hagihara, S., Otomo, K., Ishida, H., Hidema, J., Nemoto, T., Izumi, M.
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: ー Pages: ー
  • DOI: 10.1093/pcp/pcaa162
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chloroplast Autophagy and Ubiquitination Combine to Manage Oxidative Damage and Starvation Responses (2020)
  • Author(s): Kikuchi, Y., Nakamura, S., Woodson, J.D., Ishida, H., Ling, Q., Hidema, J., Jarvis, R.P., Hagihara, S., Izumi, M.
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 183 Pages: 1531-1544
  • DOI: 10.1104/pp.20.00237
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research