培養細胞における「多様化誘導型」抗体ディスプレイシステムの開発

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19H02924
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 冨塚 一磨 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (40444640)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀田 秋津 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点講師 (50578002) ; 香月 康宏 鳥取大学, 医学部, 准教授 (90403401)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 抗体医薬 / ヒト人工染色体 / 免疫グロブリン / 相補性決定領域 / ゲノム編集 / CRISPR-Cas9 / Ｗｎｔ/βカテニンシグナル

Outline of Annual Research Achievements

抗体は今や最も注目されるモダリティ（治療手段）と言えるが、一方で標的抗原の枯渇など課題も多く、従来法では取得困難な、新規な活性や機能を持つ抗体を獲得する技術の開発が待ち望まれている。本研究では、表現型スクリーニングが困難という抗体創薬のボトルネックを解消するため、一千万～一億の多様な特異性をもつ抗体分子を発現する培養細胞ライブラリ構築、およびそれを用いた表現型スクリーニングによる機能抗体取得からなるプラットフォーム技術の開発に取り組む。2020年度は、ヒト抗体（重鎖＋κ軽鎖）cDNA、ラクダ一本鎖（VHH）抗体cDNA（共に膜結合型）の発現ユニットをそれぞれ1コピー保持するヒト人工染色体（HAC）ベクターの構築を293T細胞で完了し、その発現を確認した。さらにHACベクター上の重鎖CDR3領域の30塩基（10アミノ酸）ランダム化に成功したが、ゲノム編集条件最適化の結果、10%以上と既報と比較して高いランダム化効率を達成した。加えて表現型スクリーニング実施のため、Ｗｎｔ/βカテニンシグナルのＧＦＰレポーターユニットを搭載したヒト人工染色体ベクターを293T細胞で構築完了した。全体として当初計画以上の進捗であり、2021年度末までの技術基盤確立と特許出願完了は十分可能と考えている

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

ヒト抗体（重鎖＋κ軽鎖）cDNAあるいはラクダ一本鎖（VHH）抗体cDNA（共に膜結合型）を1コピー保持する293T細胞について、CDR3領域にランダムな30塩基（10アミノ酸）を挿入するゲノム編集の条件検討を行い、10%～30%の効率でランダム化を起こさせることに成功した。ゲノム編集後、細胞を長期培養して単離したクローンにおいても、同様の割合でCDR3ランダム化が検出されたことから、達成された多様性は、細胞1億個あたり少なくとも1千万以上と考えられ、当初目標の1千万以上のライブラリサイズの実現性が示唆された。現在、さらなる効率アップを目指し条件最適化を実施中である。また表現型スクリーニングを実施するため、Wnt/βカテニンシグナルのGFPレポーターユニットを搭載したヒト人工染色体ベクターを293T細胞で構築し、Wnt3a/R-spondin添加により、期待通りGFP発現誘導が起こることをFACSで確認した。今後、本レポーターユニットと抗体遺伝子cDNAを同時搭載したHACを構築し、CDR3ランダム化によりWnt/βカテニンシグナルの強度が変化したクローンを単離し、本シグナル系を制御する抗体の同定を行う計画である。

Strategy for Future Research Activity

10～30%のランダム化効率は既報（数%）よりも高く、当初の想定以上であるが、さらなる効率向上（50%以上）を目指し、ssODN配列の様々なバリエーションについて検討を行うことを計画している。50%以上の効率が達成された先行事例はないため、これが可能になれば知財獲得の可能性がある。また、細胞内発現蛋白質へのランダムペプチド付加の事例として、GFP蛋白質のC末端部を標的としたゲノム編集の検討することで、本技術の汎用性を実証することができると期待される。