2020 Fiscal Year Annual Research Report

Study on tolerance mechanisms of pearl millet to environmental stresses

Research Project

Project/Area Number	19H02928
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	高野哲夫東京大学, アジア生物資源環境研究センター, 教授 (30183057)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	津釜大侑東京大学, アジア生物資源環境研究センター, 准教授 (10726061)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	トウジンビエ / 環境ストレス耐性 / 高温耐性 / トランスクリプトーム
Outline of Annual Research Achievements	ICRISATから分譲を受けた２系統（高高温耐性系統：ICMB00333、および低高温耐性系統：ICMB00555）を選択し、以降の実験に供試した。穂ばらみ期、出穂期、葯期に高温処理を施した植物体から小穂を回収し、RNAを抽出した。RNA-seq 解析を行った結果、2系統間で、高温ストレスに対する遺伝子発現の応答が大きく異なることがわかった。耐性系統では高温ストレスに応答して発現が上昇する遺伝子がより多く検出された。高高温耐性系統：ICMB00333でストレス処理に応答して発言が顕著に上昇する2つの遺伝子（PgPERK7およびPgTPS21）に着目し、これらの相同遺伝子を欠失したシロイヌナズナ変異系統（perk7およびtps21）を入手した。変異系統に高温ストレス処理を行い、生育状況を解析した。tps21変異体では野生型と比較して差がなかったが、perk7は野生型と比較して高温ストレスによる障害が顕著に大きかった。この結果から、PgPERK7(PROLINE-RICH EXTENSIN-LIKE RECEPTOR KINASE 7)がトウジンビエの高温耐性に関与することが示唆された。トウジンビエの遺伝子の機能解析を行うことを目的として、トウジンビエの形質転換実験系の確立を試みた。カルスからの再分化系およびin planta形質転換の2つの方法に取り組み、実験系の確立には至ってないが、今後の実験の進め方について明らかにすることが出来た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究課題について、ほぼ予定通りに実験を進めていることができていて、データも集積されつつあるため、概ね順調に進展していると評価する。
Strategy for Future Research Activity	トウジンビエのストレス耐性に関与する可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子のリストから、重要性を考慮して順次機能解析を行う。 1. トウジンビエ植物体を用いた解析対象とする遺伝子の破壊に用いるガイドRNA(sgRNA)の配列を設計し、それぞれの遺伝子に対して使用するコンストラクトを構築する。構築したコンストラクトを導入した形質転換トウジンビエ系統を育成する。当該遺伝子の塩基配列を決定して形質転換体における発現を解析し、遺伝子破壊を確認する。遺伝子破壊が確認された形質転換系統を用いて、乾燥耐性、耐塩性の試験を行い、耐性形質の変化について詳細に解析する。対象とする遺伝子を高発現する形質転換体を作成するために、適当なプロモーターにドライブされる当該遺伝子を組み込んだバイナリーベクターを構築し、トウジンビエに導入して当該遺伝子過剰発現トウジンビエ系統を育成する。過剰発現系統を用いて、ストレス耐性の試験を行い、耐性形質の変化について詳細に解析する。 2. モデル植物を用いたトウジンビエ遺伝子の機能解析モデル植物のイネおよびシロイヌナズナを用いて、対象とするトウジンビエ遺伝子の機能解析を行う。BLAST解析等を行い、当該遺伝子の相同遺伝子がある場合には、その遺伝子の欠失変異系統をイネゲノムセンターおよびABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)から入手する。入手した変異系統を用いて乾燥耐性および耐塩性に関連した形質の解析を行う。耐性形質への関与が確認できた場合は、相補試験により原因遺伝子であることを確認する。また機能未知（unknown）とアノテートされた遺伝子を中心としてイネおよびシロイヌナズナに導入して、乾燥耐性および耐塩性に関連した形質およびその他の形質に関して詳細な解析を行い、導入遺伝子の機能について解析する。