2019 Fiscal Year Annual Research Report
植物DNA修復選択システムを利用した低モザイクゲノム編集育種技術の構築
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19H02932
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
刑部 敬史 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (70450335)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 半数体 / ジェミニウィルス / DNA二重鎖切断修復 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノム編集技術による変異導入では「モザイク性変異」は、体細胞の標的ゲノム配列上に様々な変異配列タイプが不均一に混在する変異のことである。このため目的とする変異のみを持つ個体を得るためには数世代の交配と選抜を行なう必要があり、モザイク性変異を回避した一世代での変異固定を行う方法の確立は、迅速な分子育種技術を確立する上で必須の技術である。我々は、複数のgRNAを発現させるマルチプレックスCRISPR/Cas9システム（Multiplex gRNAシステム）を用い、Cas9遺伝子の発現に用いるプロモーターの種類によって、モザイク性が低く、正確な非相同末端結合（NHEJ）修復による変異導入が可能であることを見出した。この「正確な非相同末端結合修復」による変異導入様式のメカニズムとその制御について明らかにするために、本研究の供試材料であるトマトにおけるNHEJ因子である、Ku70およびKu80を見出し、その遺伝子ノックアウト株を作製をCRISPR/Cas9 gRNAの設計を進めた。今後は、作出したゲノム編集植物体の系統樹立を進める。
また、モザイク性変異を回避した一世代変異固定技術の確立に必要なトマト半数体誘導植物系統を作出するため、トマトセントロメアヒストンH3遺伝子（CENH3）のノックアウトおよび半数体誘導を誘導する改変型CENH3をトマトゲノムに導入を進めた。これまでに、CENH3上の標的箇所に変異が検出されており、今後、変異が固定され、かつ改変型<i>CENH3</i>が発現する系統樹立を進める。さらに当研究室で構築したジェミニウィルス型CRISPR/Cas9ベクターを改変するため、誘導型RepA遺伝子発現カセットの構築を進めた。今後、改良型ベクターシステムの検証を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までのところ、当初の研究計画通りに研究遂行に必要なゲノム編集植物系統およびベクターシステムの構築に着手し、ゲノム編集植物系統の作出では目的遺伝子配列に変異が導入された系統が得られてきている。以上より、本研究は当初の計画通りに順調に実験を進められている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究計画に必要な遺伝子ノックアウト系統の作出が、進められた。また必要なベクター系の構築も進んでいるため、計画通り、さらに「正確な非相同末端結合修復」の変異解析を進めていく予定である。またもう一つの研究課題である半数体誘導トマトの作出も同様に進めて行く。
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