2019 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive analysis SFBB for S-RNase in self-incompatibility of Japanese pear
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19H02946
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
安田 剛志 (高崎剛志) 神戸大学, 農学研究科, 教授 (30314511)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 加奈子 大阪大学, 超高圧電子顕微鏡センター, 講師 (00647737)
藤本 龍 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (60620375)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 自家不和合性 / ナシ / ゲノム / 細胞・組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナシ属の自家不和合性による花粉管の伸長抑制は雌ずい側因子S-RNaseが花粉管内のRNAを分解することで起こる。一方, 和合花粉管内では花粉側因子であるF-boxタンパク質群（SFBB）によりS-RNaseが無毒化されると考えられている。本研究では, SハプロタイプにコードされるSFBB群を掌握することで, S-RNaseに対する特異性を推定する。その推定をペチュニアの花粉で発現させたSFBB融合タンパク質のS-RNaseに対する結合特性を検証することを目的とした。
令和元年度は, ニホンナシのS2, S3, S4 BACコンティグ内外に存在する未解読BACクローンを次世代シークエンサーPacBioRSIIで解析し, 取得した配列を既知のコンティグに統合した。コンティグ配列はS2-RNase上流578kb~下流481kb, S3-RNase上流824kb~下流471kb, S4-RNase上流935kb~下流538kbまで拡張され, それぞれ18個, 19個, 20個のSFBBが同定された。各コンティグの両末端にはSFBB様配列は見出せなかったことから, これらSハプロタイプがコードするSFBB群を掌握できた。RNA-seqデータから構築したS1,S5-SFBB群配列の非翻訳領域から設計したプライマーセットを用いたRT-PCRにより未だクローニングされていないSFBB群配列をクローニングし, 配列を確認した。一方で, Skを有するニホンナシ品種 ‘巾着’の花粉をRNA-seq解析して, Sk-SFBB群配列を構築した。
S4-SFBB4d1およびその対立遺伝子のS1-SFBB4d1をそれぞれ導入したペチュニア形質転換を作出し, RT-PCRにより花粉での発現を確認した。
電子線トモグラフィー解析に向けた技術的な課題（試料作製法および連続傾斜撮影法など）を洗い出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BACコンティグ配列の解析によってS2, S3, S4ハプロタイプがコードするSFBB群を掌握することができた。S3, S4ハプロタイプコンティグ上にRNA-seq解析から再構築されたS3-SFBB群の存在が確認されたことから, RNA-seqデータからSFBB配列構築の妥当性が裏付けられた。このため, 研究計画は順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. Sハプロタイプのゲノム構造解析 昨年度完成したS2, S3, S4ハプロタイプのゲノム構造を詳細に解析する。各ハプロタイプに存在するパラログUTR配列の比較およびSFBB偽遺伝子の復元をすることで, 遺伝子重複により新規SFBB対立遺伝子が生じた過程を考察する。
2. PpSFBB群のRT-PCRクローニングとRNA-seq解析 RNA-seqデータから構築したニホンナシS6~9-SFBB配列のうち, 未だクローニングされていない配列をRT-PCRクローニングし, SFBBのタイプ分けを進める。これまでSFBB対立遺伝子が存在しないと判断されたハプロタイプに対してRT-PCRとゲノミックPCRを実施し, その有無を検証し, 対立遺伝子の有無からニホンナシS1~9-RNaseに対する認識特異性を推測する。
3. ペチュニアの形質転換系を用いたSFBBタンパク質の発現 昨年度作出したS4-SFBB4d1およびその対立遺伝子のS1-SFBB4d1をそれぞれ導入したペチュニア形質転換の花粉におけるSFBB融合タンパク質のホールディングを免疫沈降法により解析する。
4. 電子顕微鏡による和合・不和合花粉管の解析 昨年度明らかになった電子線トモグラフィー解析の技術的な課題の解決策をSホモ系統の受粉12時間後の花柱切片を用いて検討する。一方で, 免疫電顕観察により和合・不和合花粉管内のS-RNaseの挙動を調査する。
得られた結果を取りまとめ, 学会発表と論文発表を行う。
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