2020 Fiscal Year Annual Research Report
ウイルス感染時に誘導されるRNAサイレンシング活性化機構の解明
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19H02959
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 教授 (60560779)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
海道 真典 摂南大学, 農学部, 准教授 (20314247)
松村 浩由 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324809)
岩崎 信太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80611441)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物ウイルス / RNAサイレンシング / RNAサイレンシングの活性化 / ウイルス複製 / RNAサイレンシングサプレッサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ウイルス感染時に認められるRNAサイレンシング関連遺伝子群の発現が活性化される機構を明らかにすることである。
令和2年度には、主にAGO遺伝子の発現誘導に着目して以下の実験を行った。
（１）AGO遺伝子の発現誘導に関与するウイルス因子に関して：タバコでのアグロインフィルトレーションを用いた経時的解析から、AGO遺伝子の発現は接種2日目までに誘導され、その後AGO遺伝子の発現量が速やかに減少することが示された。この結果から、ウイルス感染後期には、積極的にAGO mRNAが分解されている可能性が示唆された。複数の植物RNAウイルス感染時にAGO遺伝子の発現誘導が報告されているため、ウイルス間で共通する複製中間体の二本鎖RNA (dsRNA)がAGO遺伝子の発現誘導に関与するウイルス因子であるという仮説を立てた。アグロインフィルトレーションでRed clover necrotic virus (RCNMV)を感染させた後、RCNMV由来のdsRNAの蓄積量をノースウエスタン法で経時的に解析した。その結果、ウイルス由来のdsRNA蓄積量と、AGO遺伝子の発現変動の間には相関が認められなかった。この結果より、植物RNAウイルス感染時のAGO遺伝子発現は、ウイルス複製時に生じるdsRNA以外の別の何かによって誘導されることが示唆された。
（２）AGO/DCL発現植物の作出に関して：コロナ禍の影響もあり、DCLのクローニングを完了できなかった。引続き、DCL遺伝子のクローニングに取り組んでいる。
（３）ウイルスRSSの機能解析に関して：ウイルスRSSの機能解析を行うための準備としてさらに5種類のRSSを用意した。16c植物を用いてこれらのRSS活性を確認した。（２）の組換え植物を作出でき次第、RSSアッセイを行える状態である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナ禍による春先の緊急事態宣言の際に大学キャンパスへの入構が禁止され、その間実験を中断したため、進捗に遅れが生じた。また、緊急事態宣言解除後も、学生のキャンパス内への入構制限が継続されたため、予定通りに研究を実施することが出来ず、進捗の遅れを取り戻せなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和２年度の進捗状況を踏まえて、令和３年度には、以下の実験を行う計画である。なお、下記の実験を可能な限り進めていく予定であるが、コロナウイルスの影響による入構制限が継続されているため、大きな遅れが見込まれる。
（１）AGO遺伝子の発現誘導に関与するウイルス因子に関して、プロトプラストを用いた実験を完了させ、投稿論文としてまとめる。ウイルス複製時に発現誘導されるAGOタンパク質が、ウイルス複製の場に局在するかどうかを検証するための系の構築に取り掛かる予定である。また、自己発光するルシフェラーゼ遺伝子の植物における機能性を確認した上で、組換え植物の作出に取り掛かる。安定的なプロトプラスト調製ができるようになり次第、Robosome profilingに取り掛かる。プロトプラスト調製の大規模化に手間取った場合、培養細胞の導入も検討する。大腸菌での複製酵素タンパク質の大量発現に苦戦しているので、植物細胞を用いた大量発現を試みる予定である。また、大腸菌において、同時に宿主因子を発現させて共精製する実験も行う予定である。
（２）AGO/DCL発現植物の作出に関して、DCL遺伝子のクローニングを完了させ、組換え植物の作出に取りかかる予定である。作出完了次第、ウイルス感染性実験と、ウイルスRSSの機能解析を行う予定である。
（３）ウイルスRSSの機能解析に関して、用意した15種類のRSSの機能解析を行い、AGO/DCL発現量が低い状態でのRSS活性を定量的に評価する。（２）の組換え植物を確立でき次第、AGO/DCL過剰発現下でのRSSの機能解析を行う予定である。
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