2019 Fiscal Year Annual Research Report
Neural mechanisms of information integration and decision-making in the higher center of insect brains
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19H02968
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
木矢 剛智 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (90532309)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | カイコ / ショウジョウバエ / 光遺伝学 / フェロモン / doublesex / fruitless / 神経活動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、昆虫の脳高次中枢における行動決断の神経機構とその神経回路の進化の解明を目的としている。本研究により、動物の脳に共通に認められる、様々な感覚情報を手掛かりに行動を決断する神経機構とその進化的基盤について、その一端を解明するものである。
本年度は、CaイメージングによるaSP2神経回路の活動動態の解析の準備（ショウジョウバエ）と、カイコガの脳高次領域で性フェロモン情報を処理する神経回路の詳細な解析を行った。
以前に我々が性行動モチベーションの制御に重要であることを見出したaSP2神経回路においてどのように情報の統合が行われているのかといったことを、Caイメージングによって明らかにするため、aSP2神経選択的にGCaMP（Caインジケータータンパク質）を発現させたショウジョウバエの作出を試みた。将来的に様々な解析をすることを念頭に、split-GAL4を用いた外来遺伝子発現系の構築に取り組んだ。そのためにfruitlessのP1プロモーターにGAL4 DNA-binding domainをCRISPR/Cas9でノックインした系統を作出した。またCaイメージングのための顕微鏡やカメラをセットアップした。
また、これまでに我々は、Hr38タンパク質が9塩基のNBRE配列に特異的に結合する転写活性化因子であることを利用した、活動依存的な神経回路可視化法(NBREシステムと名付けた)をカイコガにおいて新規に確立してきた。本年度は、NBREシステムによって活動依存的にチャネルロドプシン（光依存的に神経活動を操作できるタンパク質）を発現させた実験を行った。また、カイコガのfruitlessノックアウト系統の解析やdoublesexへのノックイン系統の作出を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ショウジョウバエを用いた研究においては、fruitlessのP1プロモーターにGAL4 DNA-binding domainをノックインした系統の樹立に成功し、Caイメージングのための顕微鏡やカメラのセットアップを行った。今後この系統やイメージング機器を利用することで目的とする解析を行うことが可能となった。
カイコガを用いた研究においては、NBREシステムによってチャネルロドプシンを発現させ、神経活動依存的にカイコガの行動を操作する実験を試みたが、GFPに比べチャネルロドプシンの脳における発現が十分でなく、実験はうまくゆかなかった。一方、性特異的な神経回路に着目し、候補の遺伝子として着目したfruitlessとdoublesexについて解析を進めた。まず、fruitlessをCRISPR/Cas9でノックアウトした系統を作出し、解析を行った。その結果、fruitlessノックアウトのオス蛾は性フェロモンに反応することはできるものの、十分な交尾行動を遂行できず子孫を残せないことを見出した。またdoublesexに関しては、doublesex発現神経回路を遺伝学的に操作することを目的にTALEN PITCh法によるGAL4ノックイン系統を作出した。今後、本系統を用いて性行動におけるdoublesex発現神経回路の機能解析を行うことができると考えられる。
上記の事項より、研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ショウジョウバエを用いた研究においては、aSP2神経回路特異的にGCaMP6fを発現する系統を用い、性フェロモン刺激によって神経活動が誘発されるのかということや、嗅覚・味覚経路の性フェロモンが加算的・相乗的に神経活動を誘発するのかということを明らかにする。またaSP2神経はグルタミン酸作動性神経であるので、fruitless発現細胞やaSP2細胞特異的にグルタミン酸トランスポーター（vGlut）のノックダウンを行い機能阻害した場合の性行動における影響を検討する。新型コロナウイルスの発生の影響でアメリカのショウジョウバエストックセンターからの供与が止まっているため、研究をどこまで進められるかは不明である。
カイコガではdoublesex遺伝子へのGAL4ノックイン系統が樹立できつつあるので、GAL4/UAS法によりdoublesex発現神経回路の形態および機能の解析を行う。このために必要なUAS-myr::GFP系統やUAS-GCaMP6f系統は作出済みであるが、新型コロナウイルスの発生の影響でカイコの飼育が停滞しているため、系統の保存を一番の目的に可能な範囲で研究を遂行する。
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