2019 Fiscal Year Annual Research Report
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19H02971
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
後藤 慎介 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (70347483)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渕側 太郎 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (90802934)
志賀 向子 大阪大学, 理学研究科, 教授 (90254383)
長谷部 政治 大阪大学, 理学研究科, 助教 (40802822)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 昆虫 / 光周性 / 概日時計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光周性においては，PERIOD（PER）を含む複数の時計タンパク質が概日時計を駆動し，この時計細胞が日長に応じてsmall neuropeptide F（sNPF）あるいはpigment-dispersing factor（PDF）といった神経ペプチドの分泌を制御し，それを前胸腺刺激ホルモン（prothoracicotropic hormone，PTTH）産生細胞が受容し，PTTH産生細胞の生理状態が変化してPTTHの合成分泌が制御され，このPTTHを受容した前胸腺の活性化状態が変化して，ホルモンであるエクジステロイドの分泌が制御されることで，休眠非休眠が切り替わると考えられる．
この仮説の検証過程で，①PERとPDFを共発現する４つの細胞，PDFを持たない１つのPER陽性細胞が存在することが示唆された．また，②前胸腺を制御していると考えられる6個のPL-i, 2個のPL-cニューロンの存在とそれらの脳内の位置が示唆された．③PL-i，PL-cニューロンの神経線維の近傍にPDF免疫陽性細胞の神経線維が投射すること，④クロバエのsNPFでデザインされた抗体がナミニクバエでも免疫組織化学実験に適用できることがわかった．さらに，⑤sNPFおよびPTTH遺伝子の部分配列が明らかになった．⑥体液エクジステロイド量のパターンの概要が明らかになった．⑦Single cell RT-PCRにより，PL細胞でのPTTH， pdf receptor，snpf, receptor 遺伝子の発現が示唆された．上記に加え，さまざまな条件で雌雄の休眠率を調べた．どの条件でもメスの休眠率は低くオスの休眠率が高いことがわかった．しかしながら，その差は大きくても50％程度であることがわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ナミニクバエは蛹で休眠に入る．蛹休眠の誘導には，概日時計，概日時計出力因子，PTTH産生細胞，PTTH，前胸腺，エクジステロイドが関わることが考えられるが，その知見は断片的であった．本研究の目的の一つは，このカスケードを神経解剖学的にそして内分泌学的に明らかにすることである．これまでの研究により，概日時計がsNPFあるいはPDFを用いて，PL細胞であるPTTH産生細胞に作用していることが見えてきた．また，休眠個体，非休眠では体液エクジステロイド量が大きく異なることがわかった．今後さらなる研究により，概日時計からエクジステロイドに至るカスケードを詳細に明らかにできる．
臨界日長には明瞭な雌雄差があるものの，オスの休眠率が100％，メスの休眠率が0%となるような環境条件は見いだされなかった．このことは，雌雄差を明らかにする実験において，幼虫の雌雄判定を明瞭に行うとともに多くの個体数を用いて実験する必要があることを示している．実験手法の方向性を見出すことが点で重要な進展である．
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| Strategy for Future Research Activity |
光周性を生み出す神経内分泌機構
「概日時計細胞から内分泌系までの解剖学的接続の解析」においては，引き続き個体数を増やして染色を行い，結果の信頼度を上げることとする．また，PL-c細胞がPTTHニューロンであるかを確認するため，PTTH遺伝子に対するin situ hybridization（ISH）を行う．ISHが成功すれば，バックフィルと二重標識を行う．sNPFがPERと共存するか，またPDFと共存するかを調べるために，免疫組織化学を行う．「概日時計細胞から内分泌系までの生理学的接続の解析」においては，脳－環状腺（前胸腺を含む）複合体における，PDF，sNPF，PTTH，PTTH受容体，エクジステロイド合成酵素の遺伝子発現および体液中のエクジステロイド量を，経時的に調べる．長日条件下で非休眠に運命づけられた個体と，短日条件下で休眠に運命づけられた個体とでは大きく異なるパターンを示すと考えられる．「PTTH細胞の電気生理学的特性の変化」においては，PL細胞からの電気生理記録の実験系を確立し，PDF，sNPF投与によるPL細胞の応答性を解析する．
臨界日長の違いを生み出す機構
地理系統差：地理系統間での臨界日長の違いは概日時計によるものであることが明らかになっている．今年度は，光周性に関与する概日時計の周期に違いがあるかどうかを，複雑な光周期を組み合わせたNanda-Hamnerプロトコルで調べる．
雌雄差：雌雄における基本的な生理状態の違いが臨界日長の違いを生み出している可能性もあるので，発育速度や羽化タイミングについて明らかにする．また，雌雄で，PDF，sNPF，PTTH，PTTH受容体，エクジステロイド合成酵素の遺伝子発現および体液中のエクジステロイド量に違いがあるかを調べる．
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