2021 Fiscal Year Annual Research Report

ビロウドカミキリからマツノマダラカミキリへ－細胞内寄生細菌の人為的導入－

Research Project

Project/Area Number	19H03004
Research Institution	Forest Research and Management Organization
Principal Investigator	相川拓也国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (90343805)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	安佛尚志国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (30392583) 高務淳国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員等 (80399378)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ボルバキア / ビロウドカミキリ / マツノマダラカミキリ / マイクロインジェクション
Outline of Annual Research Achievements	本年度も、青森県の調査地でマツ丸太を割材し、実験に使用するビロウドカミキリ終齢幼虫を採集した。これらの終齢幼虫は室温で羽化させた後、人工飼料を与えて性成熟させ、雌成虫体内から未受精卵を含む卵巣を丸ごと取り出した。その卵巣から、常法によりボルバキアを抽出してボルバキア懸濁液を作り、その懸濁液をマイクロインジェクション法によりマツノマダラカミキリの卵に注入した。レシピエントであるマツノマダラカミキリは、室内で累代飼育している個体群を用いた。羽化成虫は性成熟させた後、雌雄を交配させ、それらの雌成虫に産卵させることでインジェクション用の卵を準備した。ボルバキアを注入後孵化した幼虫は人工飼料の入った三角フラスコ内で飼育し、終齢幼虫そして蛹を経て成虫に発育するまで飼育管理した。全部で333個のマツノマダラカミキリ卵にボルバキア懸濁液を注入し、そのうち孵化したのは70頭（21％）であった。その中から無作為に孵化幼虫を8頭選び、それらに対してボルバキアの診断PCRを実施したところ、4頭からボルバキアのバンドが検出された。最終的に成虫まで発育したのは29頭で、雄成虫が11頭、雌成虫が18頭であった。これらの成虫に対しボルバキアの診断PCRを行ったところ、ボルバキアに感染していたのは雌成虫1頭だけであった。この雌成虫を解剖し卵巣の状態を確認したところ、性成熟させるための飼育期間を1か月設けたにもかからず卵巣が発達しておらず卵も存在していなかった。また、マツノマダラカミキリの細胞培養については、これまでに維持できている培養株が2～3週間程度で植え継ぎができるほど増殖が安定してきたことから、この細胞株に対しボルバキアの接種を試みた。その結果、細胞内にボルバキアが感染していることが診断PCRにより明らかとなり、透過電子顕微鏡による観察でも細胞内のボルバキアの存在が確認された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度もマイクロインジェクション法により、ボルバキアに感染したマツノマダラカミキリ成虫を得ることができたが、その数はわずか1頭（雌成虫）であった。その雌成虫は卵巣が発達しなかったため、ボルバキアが次世代に移行するかどうかの実験はできなかった。一方、マツノマダラカミキリの細胞は継続的に培養ができており、今回、その培養株にボルバキアを感染させることにも成功した。これらの結果を勘案し、おおむね計画通りに進んでいると判断した。
Strategy for Future Research Activity	ボルバキアに感染したマツノマダラカミキリ成虫をより多く得るためには、マイクロインジェクションで使用するレシピエント側のマツノマダラカミキリの卵をより効率的に生産できる体制を整える必要がある。今後はその点を改善したい。またマツノマダラカミキリの細胞培養については、ボルバキアに感染した細胞株を作ることができたことから、今後はインジェクション実験に向けて、細胞からのボルバキアの精製法を検討する。