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2020 Fiscal Year Annual Research Report

サケ科魚類の成長調節メカニズムの理解に基づいた養殖魚診断法の実用化

Research Project

Project/Area Number 19H03024
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

清水 宗敬  北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (90431337)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 棟方 有宗  宮城教育大学, 教育学部, 准教授 (10361213)
森山 俊介  北里大学, 海洋生命科学部, 教授 (50222352)
内田 勝久  宮崎大学, 農学部, 教授 (50360508)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords成長 / ストレス / ホルモン / サケ科魚類 / 養殖
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、サケ科魚類の成長に重要なインスリン様成長因子結合蛋白(IGFBP)の組換え蛋白を作製して、ゲノム編集による機能解析と免疫測定系の確立を行い、メカニズムの理解に基づいた成長・ストレスの診断法を開発することを目的としている。本年度は以下の成果を得た。
組換え蛋白の作製については、IGFBP-2b1と-2b2の組換え蛋白の作製を大腸菌発現系を用いて行った。今回は、蛋白質の折りたたみと溶解性を高めるチオレドキシンとヒスチジンタグを付加した組換えIGFBPを発現させた。その後、組換えIGFBPをニッケルカラムを用いて精製し、酵素処理を行って融合パートナーを切断した後、逆相クロマトグラフィーにより精製した。そして、脳下垂体培養系を用いた機能解析を行い、サブタイプの活性には違いがあることを示唆した。
ゲノム編集実験については、米国冷水養殖研究所と共同で作出したニジマスのIGFBP-2b1と-2b2のダブルノックアウト(KO)・ダウン(KD)F0魚に対し、絶食・再給餌実験を行った。そして、血中IGF-I(遊離型と結合型)や他のIGFBPの補償的反応を合わせて解析した。結果、給餌・絶食条件下のIGFBP-2b KO/KD魚において各パラメータの血中量そのものよりも、遊離型や結合型IGF-Iとの関係において他のIGFBPによる補償的な反応が見られた。
また、野生型ニジマスを個体標識して飼育実験を行い、IGFBPの成長指標としての有用性を検証した。血中にはIGFBP-2bと新規の32-kDa IGFBPが主に検出されたが、負の成長指標候補であるIGFBP-1aと-1bはほとんど検出されなかった。血中IGFBP-2bは個体の成長率と正の相関があり、正の成長指標としての有用性が示された。これらの解析から、各IGFBPの成長指標としての有用性は種ごとに異なると考えられた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、IGFBP-2bサブタイプの組換え蛋白を作製し、ニジマスにおけるIGFBPの成長指標としての有用性を検討することを目標としたが、いずれも達成した。
サケ科魚類には2つのIGFBP-2bサブタイプが存在するが、これらの組換え蛋白を作製することに成功した。そして、組換え蛋白の機能を脳下垂体細胞培養系を用いて解析した。結果、IGFBP-2b1単独で脳下垂体からの成長ホルモン分泌量を増加させた。一方、IGFBP-2b2にはそのような効果は見られず、サブタイプ間に機能の違いがある可能性が考えられた。ただ、本結果は予想外であったため、今後、追加実験により検証する。
これまでにサクラマスにおいてIGFBP-1aと-1bの時間分解蛍光免疫測定系(TR-FIA)を開発し、これらがストレスや成長停滞の指標になることを示してきた。今年度は、世界的に重要な養殖対象種であるニジマスにおいて血中IGF-Iと各IGFBPの成長指標としての有用性を検討した。指標を絞り込むため、まず標識ヒトIGF-Iを用いたリガンドブロッティングにより、血中量を半定量した。結果、ニジマスでは予想に反して絶食して成長が停滞している個体でもIGFBP-1aと-1bが血中にほとんど検出されなかった。一方、血中IGFBP-2bは個体の成長率と比較的高い正の相関を示し、IGF-Iと同様に正の成長指標として用いられると考えられた。本結果から、ニジマスでは成長のブレーキ役であるIGFBP-1aと-1bをあまり使わずに成長調節がなされると考えられ、種特性が考えられた。一方、血中に新規の32-kDa IGFBPが検出され、その成長調節に果たす役割が注目される。本研究の成果は、現在、投稿論文としてまとめている。
以上、予想外の結果がありながらも、着実に研究成果が出ていることから、「おおむね順調に進行している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

本年度までに、当初の目標としてきた6種類の分泌型IGFBPサブタイプの組換え蛋白作製を一通り達成した。一方で、融合パートナーからの酵素的切断の際に生じる非特的分解による収率の低さが共通の課題として出てきた。現在、酵素切断部位の配列の一部を変えて収率の向上を目指しており、来年度も継続する。一方、IGFBP-2bに関しては、チオレドキシンを含まないHisタグ付加のみの組換え蛋白を作製することで回収率を上げることに成功している。来年度はこの組換え蛋白をニジマスに生体投与して、成長ならびにIGF-Iや他のIGFBPに対する影響を明らかにする。また、脳下垂体培養系を用いた機能解析において成長ホルモンの検出感度を上げるために、成長ホルモンのユーロピウム直接標識によるTR-FIAの再確立を行う。
成長指標として有望であると考えられたIGFBP-2bについて、組換え蛋白を用いて、TR-FIAの確立を目指す。なお、IGFBP-2bに対する抗血清は作製済みである。本サブタイプのTR-FIAではIGFBP-2bを標識する競合法をまず検討し、必要があればサンドイッチ法を試す。また、ゲノム編集を施したニジマスF0世代を交配し、IGFBP-2b KOのF1世代を作出する。ホモKO個体を用いて、絶食・再給餌実験を改めて行い、血中の遊離型と結合型IGF-I、32-kDa IGFBP、組織IGF受容体mRNAなどを解析することで、IGFBP-2b KOの効果を総合的に評価する。
また、国内共同研究者は、日本各地(宮城、岩手および宮崎)でサクラマス等の種苗生産現場と連携し、高成長、高温耐性および高降海性を持った種苗の作出や選抜を試みる。そして、それらの魚の成長・ストレスを確立した指標で診断し、生産効率の向上を目指す。

  • Research Products

    (17 results)

All 2021 2020 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 6 results,  Open Access: 2 results) Presentation (2 results) Book (5 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] 冷水養殖研究所(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      冷水養殖研究所
  • [Int'l Joint Research] ベルゲン大学/ユニ研究所(ノルウェー)

    • Country Name
      NORWAY
    • Counterpart Institution
      ベルゲン大学/ユニ研究所
  • [Journal Article] Effects of growth hormone and cortisol administration on plasma insulin-like growth factor binding proteins in juveniles of three subspecies of masu salmon (Oncorhynchus masou)2021

    • Author(s)
      Yamaguchi, G., Habara, S., Suzuki, S., Ugachi, Y., Kawai, H., Nakajima, T., Shimizu, M.
    • Journal Title

      Comp. Biochem. Physiol. A

      Volume: 251 Pages: 110821

    • DOI

      10.1016/j.cbpa.2020.110821

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Photoperiodic regulation of pituitary thyroid-stimulating hormone and brain deiodinase in Atlantic salmon2021

    • Author(s)
      Irachi, S., Hall, D.J., Fleming, M.S., Maugars, G., Bjornsson. B.T., Dufour, S., Uchida, K., McCormick, S.D.
    • Journal Title

      Mol . Cell Endocrinol.

      Volume: 519 Pages: 111056

    • DOI

      10.1016/j.mce.2020.111056

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Hypothalamic agrp and pomc mRNA responses to gastrointestinal fullness and fasting in Atlantic salmon (Salmo salar, L.)2020

    • Author(s)
      Gomes, A.S., Kalananthan, T., Murashita, K., Ronnestad, I., Ishigaki, M., Takahashi, K., Silva, M.S., Wakabayashi, Y., Lai, F., Shimizu, M., Nilsen, T.O., and Martines, E.P.
    • Journal Title

      Front. Physiol.

      Volume: 11 Pages: 61

    • DOI

      10.3389/fphys.2020.00061

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Physiological changes in off-season smolts induced by photoperiod manipulation in masu salmon (Oncorhynchus masou)2020

    • Author(s)
      Suzuki, S., Takahashi, E., Nilsen, T.O., Kaneko, N., Urabe, H., Ugachi, Y., Yamahara, E., and Shimizu, M.
    • Journal Title

      Aquaculture

      Volume: 526 Pages: 735353

    • DOI

      10.1016/j.aquaculture.2020.735353

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Production of two recombinant insulin-like growth factor binding protein-1 subtypes specific to salmonids2020

    • Author(s)
      Hasegawa, R., Miura, T., Kaneko, N., Kizaki, R., Oishi, G., Tanaka, H., Sato, M., Shimizu, M.
    • Journal Title

      Gen. Comp. Endocrinol.

      Volume: 299 Pages: 113606

    • DOI

      10.1016/j.ygcen.2020.113606

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Compensatory response of the somatotropic axis from IGFBP-2b gene editing in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)2020

    • Author(s)
      Cleveland, B.M., Habara, S., Oikawa, J., Radler, L.M., Shimizu, M.
    • Journal Title

      Genes

      Volume: 11 Pages: 1488

    • DOI

      10.3390/genes11121488

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] 宮崎県沿岸域における循環型サクラマス養殖体制の確立と地域水産業の活性化2020

    • Author(s)
      内田勝久
    • Journal Title

      一般財団法人みやぎん経済研究所調査月報

      Volume: 325 Pages: 2-8

  • [Presentation] シロザケ稚魚の成長に及ぼす降海前後の摂餌状態と低水温の影響2021

    • Author(s)
      及川 仁・中村 周・金子信人・虎尾 充・越野陽介・清水宗敬
    • Organizer
      令和3年度日本水産学会
  • [Presentation] 人工水路によるサクラマス好適種苗の選別法の検討2021

    • Author(s)
      植松康成・松田裕之・棟方有宗・阿部倫久・矢田崇
    • Organizer
      令和3年度日本水産学会春季大会
  • [Book] 海洋と生物(章分担):サクラマス その生涯と生活史戦略 (17) ドローンによる空からの行動追跡2020

    • Author(s)
      棟方有宗
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      生物研究社
  • [Book] 海洋と生物(章分担):サクラマス その生涯と生活史戦略 (18) 切欠き魚道の試行2020

    • Author(s)
      棟方有宗
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      生物研究社
  • [Book] 海洋と生物(章分担):サクラマス その生涯と生活史戦略 (19) サクラマス研究のアウトリーチ(初等教育)2020

    • Author(s)
      棟方有宗
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      生物研究社
  • [Book] 海洋と生物(章分担):サクラマス その生涯と生活史戦略 (20) サクラマス研究のアウトリーチ(国際研究・教育交流)2020

    • Author(s)
      棟方有宗
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      生物研究社
  • [Book] 海洋と生物(章分担):サクラマス その生涯と生活史戦略 (21) サクラマスの生活史戦略2020

    • Author(s)
      棟方有宗
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      生物研究社
  • [Remarks] 研究代表者ホームページ

    • URL

      https://www.fishendocrinology.com

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Published: 2021-12-27  

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