2019 Fiscal Year Annual Research Report
水産資源生物の繁殖・被食・加入過程への環境DNAによるアプローチ
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19H03031
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
益田 玲爾 京都大学, フィールド科学教育研究センター, 准教授 (60324662)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
源 利文 神戸大学, 人間発達環境学研究科, 准教授 (50450656)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 環境DNA / 水産資源生物 / 被食 / 繁殖 / 種特異的プライマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は最新の環境DNA技術を駆使して，水産生物の産卵や被食，加入といった生活史イベントを検知し，そのプロセスを明らかにすることを狙いとする．環境DNAは生物が水中に放出するDNAの総称であり，生物は平常時にも一定量を放出するとともに，繁殖行動に際しては，ミトコンドリアDNAに比べて多量の核DNAを放出する．また，被食個体は大量の体液を放出するため，ここには長鎖のDNA断片が相対的に多いと予想される．そこで水槽実験とフィールド調査により，核DNAとミトコンドリアDNAの比で繁殖を，また長鎖と短鎖ミトコンドリアDNAの比で被食を，それぞれ検知できる可能性を探る．
マアジとカタクチイワシについて，既存の短鎖プライマーの領域をカバーする長鎖プライマー，および核DNAを対象領域とする核プライマーを作成し，特異性を確認した．また，キジハタとマナマコについて，それぞれミトコンドリアの短鎖プライマーを開発した．
異なる3サイズ群のマアジを飼育した水槽から海水を採取し，核およびミトコンドリアプライマーで検出される環境DNAの動態を調べた．その結果，核に対するミトコンドリアDNAの割合は，当歳魚の2群よりも1歳魚の群で低くなることが明らかになった．このことは，成長に伴う代謝の低下を反映していると考えられ，これを利用して環境DNAにより対象種の年級群を識別できる可能性があることが示された．
舞鶴湾および福井県内浦湾で採取された海水について，ステリベクスとGFFという2種類のフィルターで並行してろ過して得た環境DNAの検出量を比較するとともに，これらを潜水目視により推定されるバイオマスと比較した．両タイプのフィルターで検出されるDNA量は強く相関し，かつこれらは目視推定バイオマスとも相関した．また，ステリベクスは少量の検出に優れ，GFFは多量のDNAがあるときの定量性に優れていることもわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プライマーの設計および特異性の確認を予定通り進めている．
カタクチイワシは2019年5月に収容した親魚候補の飼育水槽の排水について，核・ミトコンドリア短鎖および長鎖の3種類のプライマーを適用して，4ヶ月間のモニタリングを行なった．3種類のプライマーは，親魚個体の飼育期間中，ほぼ同調した推移を示した．この親魚群からは受精卵が得られず，したがって核プライマーによる産卵の検出も行えていない．2020年2月に親魚を追加し，モニタリングを継続している．
野外でクロダイの産卵のモニタリングを試みたが，2019年度には産卵が確認できなかった．一方，河川での採水試料について，日本海に比べて干満差の大きい瀬戸内海に面した広島県の太田川で採水を行い，クロダイの河川進入の様子を捉えることに成功した．
キジハタの体長3.7～37cmの18個体を水槽で個別飼育し，本種のミトコンドリア短鎖プライマーを適用し，体サイズと検出量の関係を調べたところ，放出量はほぼ体重に比例することが明らかになった．また，各個体について3日間の昼夜連続の動画撮影を行い，活動性と環境DNA放出量の日周性の関係を検討した結果，本種は時間帯に関わりなく環境DNAを放出することがわかった．加えて，キジハタの種苗生産施設で産卵期に2時間間隔で24時間の採水を行い，卵の計数と環境DNA分析の結果を照合した．産卵は夜の10時にピークとなったが，短鎖のプライマーで見る限り，環境DNA放出量に明瞭なピークは認められなかった．
京都府舞鶴湾で年間にわたり毎週採取した海水試料について，マナマコの種特異的プライマーを適用したところ，環境DNA量が潜水目視で得た個体数と良く一致すること，また産卵期である5月に環境DNAの検出量が高まることが明らかとなった．
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年2月に収容したカタクチイワシの親魚候補は順調に生き残っており，受精卵が得られ次第，これらをふ化させて仔魚を飼育し，マアジ幼魚に捕食させる実験を行う．一方，受精卵が得られなかった場合に備えて，定置網に入ったカタクチイワシ稚魚を捕食者（キジハタ）に給餌し，その際のカタクチイワシの環境DNA放出をモニタリングする実験を予定している．捕食者としてはさらに，餌をちぎって食べるイシガニなどの甲殻類についても試みる．いずれの場合も，被食直後に長鎖DNAが多く検出される可能性を確認する．
キジハタについては，環境DNA量からバイオマスが直接推定できることがわかった．そこで，沿岸のハビタットとキジハタのバイオマスの関係を明らかにするための野外調査を若狭湾の各地で行う．調査に際しては，環境DNA分析のための試料採水に加えて，潜水目視調査によりキジハタの体長および密度推定と海底の植生について記録する．これにより，特にホンダワラ類の繁茂する藻場が本種の生息場として重要である可能性を検討する．
クロダイの核プライマーおよびミトコンドリア長鎖プライマーを開発する．また，本種の産卵調査と並行しての環境DNA採水を舞鶴湾と広島湾で，また河川進入の環境DNAモニタリングを京都府伊佐津川・由良川および広島県太田川をフィールドとして行う．
舞鶴湾の桟橋で採取された海水からは，マナマコの産卵期に多量の環境DNAが検出された．そこで，産卵に際して本種の環境DNAが多量に放出されることを確認するため，飼育したマナマコに催熟ホルモンのクビフリンを注射し，放卵放精させた状態で採水し，環境DNAの動態をモニタリングする．
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