2022 Fiscal Year Annual Research Report
褐藻類の有用多糖類およびカロテノイド類代謝関連酵素の探索と機能実証
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19H03039
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
井上 晶 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (70396307)
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2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 褐藻類 / 多糖類 / アルギン酸 / フコイダン / カロテノイド / キサントフィル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、褐藻の多糖類とカロテノイド類の生合成や代謝に関わる酵素のタンパク質レベルでの機能実証を目的としている。多糖類では、含有量が多く、陸上植物、紅藻、および緑藻にはみられないアルギン酸を基質とする酵素の研究に取り組んだ。カロテノイド類については、リコペンから複数の酵素の作用で主要成分のフコキサンチンが生じると推測されているが、その各段階で働く酵素について、新たに構築したバキュロウィルス発現系を用いて機能を調べた。
アルギン酸は、β-D-マンヌロン酸（M）とα-L-グルロン酸（G）から構成されており、まずMが連続したポリマンヌロン酸が生じ、マンヌロン酸C5-エピメラーゼ（MC5E）の作用により、一部のMがGへとエピマー化される。この酵素はアルギン酸のM/G比およびそれらの配列の制御を担っており、人工的にアルギン酸のM/G組成を制御するテーラーメイドアルギン酸技術の構築には欠かせない。これまでにマコンブやワカメなど寒冷性の褐藻から候補遺伝子をクローニングし、昆虫細胞による分泌発現系を構築してきたが、性状を評価するために十分な酵素量を得ることが困難であった。一方、亜熱帯性褐藻のオキナワモズクから単離した3種類のMC5E候補遺伝子を用いた場合には、いずれも大量発現に成功し、高純度の酵素を得ることができた。いずれの酵素もMC5E活性をもつことを明らかにするとともに、至適条件を決定した。興味深いことに、いずれの酵素も既知のマコンブのMC5Eと比較して耐熱性に優れていることが分かった。
カロテノイド類については、ゼアキサンチンの変換を担うと予測した3つの候補タンパク質について、マコンブとワカメからそれらの遺伝子をクローニングし、組換えウィルスを用いて機能を調べた。いずれの酵素もゼアキサンチンの変換活性は検出することはできなかったが、酵素の熱安定性が克服すべき課題であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していたアルギン酸の生合成や代謝に関連する酵素については、発現方法の構築に成功しただけでなく、由来生物を変更することで効率的な生産が可能となり、順調に当初の目的を達成しつつある。また、その過程で予期していなかったアルギン酸代謝機構の存在がアルギン酸分解細菌に発見されたため、その解明にも取り組み、これまでに知られていない新しい酸化代謝システムの全容の解明に成功した。フコイダンについては、褐藻由来の生合成、代謝関連酵素の発見には至らなかったものの、新規のフコイダン分解細菌の単離に成功し、それがもつ複数の酵素を組み合わせることで様々なサイズのフコイダン由来オリゴ糖が生じることを明らかにした。これらの酵素についても当該菌のドラフトゲノム解析により一次構造を解明することに成功し、得られた知見を基盤として相同タンパク質を褐藻類で探索することが可能となった。
カロテノイド類については、リコペンからβ-カロテンへの変換を担うリコペンβ-シクラーゼとβ-カロテンをゼアキサンチンへと変換するβ-カロテン水酸化酵素の機能同定に成功した。ゼアキサンチンを基質とする酵素については未だに機能的に同定できていないが、候補タンパク質の安定性に原因があることが分かった。そのため、対象とする褐藻を亜熱帯性のものに変更することで解決可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
テーラーメイドアルギン酸技術の実用化を加速するには、複数のMC5Eの大量生産が必須であるが、酵素が容易に失活しないことも重要である。これを克服するためには、比較的暖かい水温を好む褐藻の酵素を対象とすることが有効であることをこれまでに見出した。今年度は、構築した生産技術と知見を基盤として、オキナワモズクおよびヒジキ由来の複数のMC5E候補タンパク質発現系の構築と性状評価を進める。さらに、各酵素のさまざまな組み合わせで、ポリマンヌロン酸のM/G組成がどのように変化するのかについて調べる。得られた結果から、褐藻のMC5Eを用いたアルギン酸のM/G組成制御方法を提案する。これに加えてアルギン酸分解に関与すると予測される褐藻の酵素の存在が予備実験により示唆された。この酵素は従来のアルギン酸分解酵素とは全く異なる一次構造をもっていたことから、新規のものと推測された。この組換えタンパク質の発現系については、既に昆虫細胞を用いて確立することができた。そのため、本酵素の性状解析についても進め、遺伝子レベルでは予測が不可能であった未知のタンパク質の機能を解明する。
細菌由来のフコイダン分解酵素については、これまでに4種類の酵素の大腸菌発現系を構築し、機能解析を進めてきた。今年度も引き続き、それらの分解様式の解明を目的として実験を進めるとともに、褐藻におけるそれらの相同タンパク質の探索を進める。
カロテノイド代謝関連酵素については、ゼアキサンチンエポキシダーゼ活性をもつ酵素の活性評価を進める。今年度は、熱安定性がこれまで使用してきた候補タンパク質よりも優れていると考えられるオキナワモズクまたはヒジキ由来のゼアキサンチンエポキシダーゼ候補タンパク質のcDNAクローニングを行い、これらの組換えバキュロウィルスを作成し、昆虫細胞を用いて機能を解析する。
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